hsa-miR-5688 靶向 FOXC1：打破乳腺癌干细胞化疗耐药的新希望

本文揭示乳腺癌干细胞（CSCs）化疗耐药机制，发现 FOXC1 与 OCT4/SOX2 形成前馈激活环促进耐药和干性。hsa-miR-5688 可靶向 FOXC1，破坏该环，增敏 CSCs。研究为乳腺癌无复发生存治疗提供新方向，有望改善患者预后。

　　

引言

癌症干细胞（CSC）理论指出，乳腺癌 CSC 是一群具有自我更新、化疗耐药和肿瘤起始能力的细胞亚群，在乳腺癌的耐药、复发和不良预后中起着关键作用。CSC 表达多种干性和多药耐药相关蛋白，且具有活跃的 DNA 修复系统，使其难以被传统疗法清除。

FOXC1 作为 “叉头盒”（FOX）基因家族成员，在多种癌症的发展和预后中发挥重要作用。在乳腺癌中，其高表达与患者总体生存率低和脑转移无进展生存期短相关，且能促进癌细胞的增殖、迁移和侵袭。此外，FOXC1 还参与调控 CSC 相关信号通路，但其在 CSC 获得性化疗耐药中的作用尚不明确。

微小 RNA（miRNA）是一类非编码 RNA，可通过与靶基因 mRNA 的 3′非翻译区（3′UTR）互补结合，抑制翻译或促进 mRNA 降解，从而调控基因表达。miRNA 在癌症的发生、发展和治疗中具有重要作用，多种 miRNA 已成为癌症治疗的潜在靶点。因此，探究 FOXC1 在乳腺癌 CSC 化疗耐药中的作用及寻找靶向 FOXC1 的 miRNA，对开发新的乳腺癌治疗策略具有重要意义。

结果

1. 固有化疗耐药的 CSCs 在化疗期间获得更多耐药性：用 2.5-μM 阿霉素（Dox）处理乳腺癌细胞系 MCF-7、MDA-MB-231 和 MDA-MB-468 24 小时后，发现 Dox 可诱导非干细胞癌细胞（NSCC）凋亡，但对 CSC（CD44⁺/CD24^-）无明显影响。CSC 富集的 2⁰球体比相应癌细胞具有更高比例的 CSCs 和耐药标记物。进一步研究发现，Dox 处理 CSCs 后，其干性和耐药因子表达增加，提示 Dox 诱导的 CSC 干性和耐药性增加可能与肿瘤复发有关。
2. 化疗增加 FOXC1 表达，降低总体生存率和无复发生存率：研究发现，乳腺癌 CSCs 中 FOXC1 在 mRNA 和蛋白质水平上的表达均高于 NSCCs。化疗后，患者体内 FOXC1 表达显著增加，且高表达 FOXC1 与化疗后乳腺癌患者无复发生存率和无事件生存率降低相关。这表明 FOXC1 可能在乳腺癌 CSC 对化疗的耐药性中起重要作用。
3. 鉴定干细胞因子为 CSCs 中 FOXC1 的正向调节因子：通过对乳腺癌患者数据集的分析，发现 FOXC1 与干性因子 OCT4、SOX2、NANOG 以及耐药因子 ABCG2 之间存在正相关。JASPAR 数据库预测及实验验证表明，OCT4 和 SOX2 可与 FOXC1 启动子结合，且 shRNA 介导的 OCT4 或 SOX2 敲除可显著降低 FOXC1 的表达。这证实了干性因子 OCT4 和 SOX2 在调节 FOXC1 表达中的重要作用。
4. FOXC1 在 CSCs 中转激活干性和耐药因子：shRNA 介导的 FOXC1 敲低导致 CSCs 中 OCT4 和 SOX2 表达显著降低，提示 FOXC1 与 OCT4/SOX2 之间存在相互激活的前馈环。JASPAR 数据库预测及实验验证发现，FOXC1 可与 OCT4、SOX2、NANOG 和 ABCG2 的启动子结合，调控它们的表达。这表明 FOXC1 在 CSC 的干性和耐药性维持中起关键作用。
5. CSCs 中 FOXC1 与多能性因子 OCT4 和 SOX2 存在相互前馈激活环，促进化疗后获得性耐药：通过染色质免疫沉淀（ChIP）实验证实，FOXC1 与 OCT4、SOX2 之间存在相互激活的前馈环。化疗可增强该环的活性，导致 CSCs 中干性和耐药因子表达增加。这一发现揭示了 CSC 在化疗后获得性耐药的重要分子机制。
6. 下调 FOXC1 使 CSCs 对化疗药物阿霉素敏感，即使经过多个周期：FOXC1 敲低的 CSCs 在 Dox 处理后，凋亡率显著增加，且经过多个化疗周期后，肿瘤体积明显减小。体内实验也证实，FOXC1 敲低联合 Dox 治疗可显著降低肿瘤体积，减少肿瘤组织中干性和耐药因子的表达。这表明下调 FOXC1 可使 CSCs 对 Dox 敏感，有效抑制肿瘤生长。
7. FOXC1 敲除通过下调干性和降低耐药性使 CSCs 对化疗敏感：化疗后，FOXC1 敲低的 CSCs 中干性和耐药因子的表达显著降低，球体形成能力和肿瘤复发能力也明显减弱。这进一步证明了 FOXC1 在调控 CSC 干性和耐药性中的关键作用，以及敲除 FOXC1 对增强 CSC 化疗敏感性的重要意义。
8. 降低 FOXC1 可抑制化疗后的复发：研究表明，CSCs 在肿瘤复发中起关键作用。FOXC1 敲低联合 Dox 治疗可显著抑制 CSCs 的复发能力，减少复发菌落的形成。这为乳腺癌的治疗提供了新的策略，即通过抑制 FOXC1 来降低肿瘤复发的风险。
9. 鉴定靶向 FOXC1 表达的新型 miRNA，使化疗耐药的 CSCs 敏感：通过数据库搜索，发现 hsa-miR-5688 可能靶向 FOXC1。过表达 hsa-miR-5688 可抑制 FOXC1 表达，破坏 FOXC1-OCT4/SOX2 前馈环，降低 CSCs 的干性和耐药性，增加其对化疗的敏感性。这表明 hsa-miR-5688 有望成为治疗乳腺癌的新靶点。
10. hsa-miR-5688 靶向 FOXC1 抑制肿瘤复发：过表达 hsa-miR-5688 联合 Dox 治疗可显著诱导 CSC 凋亡，减少球体形成和复发菌落的大小，降低 CSCs 的分化能力，有效抑制肿瘤复发。这进一步验证了 hsa-miR-5688 在乳腺癌治疗中的潜在应用价值。

讨论

癌症治疗中，耐药性是一个重大挑战，而 CSC 在耐药和肿瘤复发中起着关键作用。本研究揭示了 FOXC1 在乳腺癌 CSC 化疗耐药中的新作用机制，即 FOXC1 与 OCT4/SOX2 形成相互激活的前馈环，促进 CSC 的干性和耐药性，导致化疗后肿瘤复发。

新辅助化疗（NACT）虽为乳腺癌治疗的重要手段，但会增加 CSC 数量，提高复发风险。本研究发现，FOXC1 敲低联合化疗可有效抑制 CSC 的干性和耐药性，降低肿瘤复发潜力，为乳腺癌治疗提供了新的策略。

此外，本研究还鉴定出 hsa-miR-5688 可靶向 FOXC1，下调其表达，抑制 CSC 的干性和耐药性，增强化疗敏感性，为乳腺癌的治疗提供了新的潜在靶点。将 hsa-miR-5688 与化疗联合应用，有望成为改善乳腺癌患者预后、提高长期生存率的有效治疗方案。

材料和方法

1. 细胞培养：MDA-MB-468、MDA-MB-231、MCF-7 和 4T1 乳腺癌细胞系购自印度浦那的国家细胞科学中心，在完全 RPMI 和 DMEM 培养基中，于 37°C、5% CO₂的湿润培养箱中培养，细胞传代不超过 6 个月。
2. 球体培养：将细胞以 2.5×10⁴个细胞 / 孔的密度接种于六孔超低附着板，在含有特定生长因子和补充剂的 Dulbecco 改良 Eagle 培养基 / F12 培养基中进行球体培养，每周进行胰蛋白酶消化和传代。
3. 分选纯 CSCs 和 NSCCs：通过磁珠分选法（MACS），利用 CD24 和 CD44 抗体，从乳腺癌 2⁰球体中分离出 CD44⁺/CD24^?的 CSC 亚群和 CD44^?/CD24^?、CD44^?/CD24⁺、CD44⁺/CD24⁺的 NSCC 亚群。
4. cDNA 合成、半定量和定量实时 PCR：使用 TRIzol 试剂提取细胞总 RNA，逆转录为 cDNA 后进行半定量 PCR 或实时 PCR。利用特定引物扩增目的基因，通过 2% 琼脂糖凝胶电泳分析半定量 PCR 产物，用 ΔΔCt 法计算实时 PCR 的相对表达量。
5. 蛋白质免疫印迹（Western blot）：制备细胞裂解液，测定蛋白质浓度后进行 SDS-PAGE 电泳，将蛋白质转移至聚偏二氟乙烯膜上，用特定抗体进行免疫印迹，通过化学发光法检测蛋白表达水平，以 β-Actin 作为内参。
6. 染色质免疫沉淀（ChIP）：按照 Millipore 标准程序进行 ChIP 实验，用于检测转录因子与启动子的结合情况。提取 DNA 后进行半定量或实时 PCR 分析，计算目的基因的相对表达量。
7. 慢病毒介导的 FOXC1-shRNA 转导：通过瞬时转染 HEK 细胞包装慢病毒，将 FOXC1-shRNA 或对照慢病毒载体转导至 MDA-MB-468 CSCs 和 4T1 2⁰球体中，筛选稳定转染的细胞。
8. 质粒和转染：使用 Lipofectamine-2000 将 OCT4-shRNA、SOX2-shRNA、FOXC1-shRNA、对照 scramble-shRNA 和 hsa-miR-5688 mimic 等转染至细胞中，转染后 34 - 36 小时收集细胞，通过 RT-PCR 评估敲低效果。
9. CSCs 的处理：用 2.5 μM 的 Dox 处理乳腺球和分选的 CSCs 24 小时，以评估化疗对细胞的影响。
10. 复发实验：将 MDA-MB-468 的 1⁰球体分为 6 组，分别进行不同处理，经过 3 个周期的处理后，通过流式细胞术分析细胞凋亡率，通过 MACS 分选获得纯 CSCs，分析干性和耐药因子的表达，同时进行球体形成和菌落形成实验。
11. 原发性人类组织样本：收集 5 例原发性乳腺癌患者的组织样本，经 MACS 分选获得纯 CSCs 和 NSCCs，进行 RNA 分离、cDNA 合成和实时 PCR 分析。
12. 流式细胞术：使用流式细胞仪分析 CSC 标记物 CD44 和 CD24 的表达，以及细胞凋亡率和细胞内蛋白的表达水平。通过特定的染色和抗体标记，利用 BD FACSVerse 和 BD FACSVerse Suite 软件进行数据采集和分析。
13. 动物实验：将 Foxc1-shRNA 或对照 scramble 稳定转染至小鼠乳腺癌 4T1 细胞系，构建荷瘤小鼠模型。将小鼠分为不同组，接种相应的细胞后，观察肿瘤生长情况，进行化疗处理，最后测量肿瘤体积，分析肿瘤组织中 CSCs 的比例和相关基因的表达。
14. 分子对接和蛋白质 - DNA 复合物建模：从 AlphaFold 数据库获取转录因子的 3D 结构，使用 W3DNA 网络服务器生成 DNA 坐标，通过 HADDOCK 网络服务器进行蛋白质 - DNA 对接，对对接后的复合物进行能量最小化处理，并用 PyMOL 进行分析。
15. 表达、生存、相关性和推定的 FOXC1-miRNA 靶标分析：利用公开数据集分析 FOXC1 与化疗的关系，通过 R2 数据库和 Kaplan-Meier 绘图仪评估 FOXC1 与疾病预后的相关性，使用 Mir-Carta 和 DIANA 工具数据库预测靶向 FOXC1 的 miRNA。
16. 启动子分析：从 EPD 数据库获取基因启动子序列，使用 JASPAR 数据库预测转录因子与启动子的结合位点。
17. 统计分析：实验数据以平均值和标准误差表示，使用 GraphPad Prism 8.00 软件进行统计分析，采用未配对 Student's t 检验评估均值差异的统计学显著性，α 水平设定为 0.05。

本研究通过一系列实验，深入揭示了乳腺癌 CSC 化疗耐药的分子机制，发现了 FOXC1 在其中的关键作用，并鉴定出 hsa-miR-5688 作为潜在的治疗靶点，为乳腺癌的治疗提供了新的思路和策略，有望改善乳腺癌患者的预后，提高其长期生存率。未来的研究可进一步探索 hsa-miR-5688 的临床应用潜力，以及与其他治疗方法的联合应用效果，为乳腺癌的精准治疗奠定基础。