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在神经科学研究中，神经元独特的形态结构依赖精确的细胞内运输和信号调控。为探究相关机制，研究人员聚焦 Endosomal 蛋白 DENND10，经 CRISPR 基因编辑等实验发现，DENND10 促进神经突延伸，且涉及 Rab GTPase 信号和 CCC 复合体等下游通路，为神经发育研究提供新视角。
神经元，作为神经系统的基本单元，其长长的神经突（neurite）就像一条条信息高速公路，负责在细胞间传递各种信号，构建起复杂的神经网络。然而，这些神经突的发育和延伸过程却极为复杂，涉及到细胞内运输、信号传导等多个精细调控的环节。一旦这些过程出现异常，就可能引发各种神经系统疾病，如阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease）和帕金森病（Parkinson’s disease）等。目前，虽然科学家们已经知道内体运输（endosomal transport）途径在神经元发育中起着关键作用，但对于其中许多具体分子机制仍知之甚少，尤其是一些关键蛋白在这一过程中的作用尚未完全明确。
为了深入探究神经元形态发生的奥秘，来自苏州大学苏州医学院生命科学学院等多个机构的研究人员开展了一项重要研究。他们将目光聚焦在一种名为 DENND10 的古老内体蛋白上，试图揭开它在神经元发育过程中的神秘面纱。经过一系列深入研究，研究人员发现 DENND10 在神经突延伸过程中发挥着至关重要的作用，这一发现为理解神经元形态发生的分子机制提供了全新的视角，也为相关神经系统疾病的研究和治疗提供了潜在的新靶点。该研究成果发表在《iScience》杂志上。
研究人员在开展此项研究时，主要运用了以下几种关键技术方法：一是利用 CRISPR/Cas9 基因编辑技术，构建了 DENND10 基因敲低的细胞模型；二是通过串联质谱标签（TMT） - 基于的定量质谱技术，分析细胞在不同状态下的蛋白质组变化；三是运用免疫沉淀（IP）、免疫荧光（immunofluorescence）、蛋白质免疫印迹（Western blotting）等技术，研究蛋白质之间的相互作用、定位及表达变化。研究中使用的样本主要来源于小鼠 CAD 细胞系和小鼠原代皮质神经元。
下面来详细看看研究结果：
- DENND10 参与神经突延伸：研究人员以小鼠 CAD 细胞为模型，运用慢病毒介导的 CRISPR/Cas9 基因编辑技术，成功构建了 DENND10 基因敲低的细胞系 sgDennd10_No1 和 sgDennd10_No2。实验结果显示，与对照组相比，sgDennd10 细胞的神经突明显更短更细，神经突长度显著缩短。同时，神经元特异性细胞骨架蛋白 TUBB3 在 sgDennd10 细胞中的定位也发生改变，主要局限于细胞体，而非正常情况下的神经突。此外，重新引入外源的 Citrine - DENND10 蛋白能够挽救神经突缩短的缺陷，这充分表明 DENND10 是神经突正常生长所必需的。
- 神经突生长过程中蛋白质组学景观的变化：为系统研究 DENND10 缺陷对神经突生长的影响，研究人员对不同状态的 NC 和 sgDennd10_No2 细胞进行 TMT - 定量质谱分析。主成分分析（PCA）结果表明，神经突生长涉及两个不同的过程：一是分化诱导的生化变化，如细胞周期退出和脂质生物合成酶的上调；二是由 DENND10 调节的预先存在的囊泡运输系统。进一步分析发现，DENND10 缺陷导致与神经元运输相关的多种途径显著下调，同时一些内质网应激反应蛋白等分子模块上调。
- DENND10 调节神经突生长的发育能力：研究人员通过检测 PKA 和 Akt 信号通路相关蛋白的磷酸化水平，发现 sgDennd10 细胞在分化过程中这些信号通路的变化与 NC 细胞相似，这说明 DENND10 缺陷导致的神经突缩短并非是因为分化信号通路的破坏。同时，研究还发现，无论细胞是否分化，sgDennd10 细胞中多种神经元特异性蛋白的表达均显著降低，这表明 DENND10 在维持神经元分化前的囊泡运输系统中起着重要作用，该系统对神经突延伸的发育能力至关重要。
- Rab27 激活在 DENND10 缺陷神经元中受损：研究人员此前发现 DENND10 与 Rab27a 和 Rab27b 相互作用，而 Rab27 在神经突内的顺向运输和突触小泡胞吐中起关键作用。本研究中，他们发现活性 Rab27 定位于神经突尖端，而在 sgDennd10 细胞中，Rab27a 和 Rab27b 在神经突尖端的定位显著减少，这表明 DENND10 缺陷会降低 Rab27a 和 Rab27b 的激活，并损害它们向神经突的运输。此外，表达组成型激活的 Rab27 - QL 突变体能够挽救 sgDennd10 神经元的神经突生长，这进一步表明与神经突生长相关的 Rab GTPase 信号通路位于 DENND10 的下游。
- Dennd10 缺陷可由 CCC 复合体亚基 CCDC22 挽救：通过免疫沉淀筛选 DENND10 相互作用蛋白，研究人员发现 DENND10 与 CCC/Retriever 内体复合体密切相关，其中 CCDC22 是该复合体中与 DENND10 相互作用的关键蛋白。在野生型 CAD 细胞中敲低 Ccdc22 的表达会显著缩短神经突长度，而在 sgDennd10 细胞中过表达 Citrine - CCDC22 则能显著促进神经突生长，这表明 CCDC22 在促进神经突生长中起着重要作用，且在 DENND10 下游发挥功能。
- DENND10 和 CCDC22 对原代神经元神经突发育很重要：由于 CAD 细胞的神经突未极化，研究人员进一步利用原代神经元进行研究。结果显示，在原代皮质神经元中转染靶向 Dennd10 或 Ccdc22 的 shRNA 后，神经元的树突明显缩短，且轴突发育受损，这表明 DENND10 和 CCDC22 在体内神经突生长和发育中均起着关键作用。
综合研究结果和讨论部分，此项研究明确了 Endosomal 蛋白 DENND10 在神经突延伸发育中的关键作用。研究揭示了神经突生长涉及两个相对独立的过程，DENND10 主要影响其中的囊泡运输系统，而不显著改变分化的生化过程。Rab GTPase 信号通路和 CCC 复合体亚基 CCDC22 位于 DENND10 的下游，共同调节神经突的生长。这些发现不仅有助于深入理解神经元形态发生的分子机制，还为研究与膜运输相关的神经系统疾病的病因提供了重要线索，为未来开发相关治疗策略奠定了基础，在神经科学领域具有重要的理论和实践意义。
