编辑推荐：
本文聚焦着色芽生菌病（CBM），利用中性粒细胞耗竭小鼠模型及体外共培养实验，探究中性粒细胞在抵御 Fonsecaea monophora（F. monophora）感染中的作用。发现其对真菌清除、炎症调控及抑制真菌形态转变意义重大，为 CBM 治疗提供新思路。
1 引言
着色芽生菌病（Chromoblastomycosis，CBM）是一种由暗色真菌引起的慢性皮下感染性疾病，被视为被忽视的热带病（NTD） 。Fonsecaea 属真菌是常见致病菌，其中 F. monophora 在我国南方 CBM 致病菌中占比超 80%。CBM 治疗棘手，治愈率低、复发率高且疗程长，给患者和社会带来沉重负担。
CBM 的发展与病原体和宿主的相互作用密切相关。宿主免疫细胞对真菌的清除能力受损是疾病慢性化的重要原因，因此研究抗真菌免疫机制，尤其是感染早期机制至关重要。在 CBM 患者病变组织中，有大量混合炎症细胞浸润，包括中性粒细胞（polymorphonuclear neutrophils，PMNs）、单核吞噬细胞和淋巴细胞 。巨噬细胞在 CBM 中主要起抑菌而非杀菌作用，且与组织纤维化有关；适应性免疫反应以 Th2 细胞反应为主，清除病原体能力较弱。相比之下，中性粒细胞在 CBM 中的作用研究较少，其功能和机制尚不明确。
中性粒细胞作为固有免疫的第一道防线，在抗真菌免疫中发挥多种作用，如吞噬作用、释放活性氧物质（reactive oxygen species，ROS）、脱颗粒以及形成中性粒细胞胞外陷阱（neutrophil extracellular traps，NETs） 。NETs 可捕获和杀死真菌、细菌，无需直接吞噬。中性粒细胞减少是侵袭性真菌感染的重要危险因素，但在皮下真菌感染中，其作用存在争议。在 CBM 感染研究中，中性粒细胞的作用也存在矛盾观点，因此需要进一步明确其在 CBM 感染过程中的精确作用。
2 材料和方法
本研究严格遵循动物研究伦理准则和 “3R” 原则，所有动物实验均按照美国国立卫生研究院指南进行，并经南方医科大学皮肤病医院伦理委员会批准（批准号 2018002，2018 年 3 月 7 日修订），尽力减少动物痛苦。
实验使用的 F. monophora 野生菌株（CBS 269.37）于 1936 年从南美洲分离，在马铃薯葡萄糖琼脂（Potato Dextrose Agar，PDA）上 26°C 培养 10 天收集分生孢子，通过离心、过滤等操作调整浓度至 2×107/mL 。在 Sabouraud 肉汤（SDB）中 28°C 振荡培养 14 天获得菌丝片段，经不同孔径滤网过滤得到 20 - 40μm 的菌丝接种物 。通过特定培养基和添加 Nikkomycin Z，在 35.5°C 诱导 60 天获得硬化细胞。
选用 6 周龄、体重 19 - 21g 的 SPF 级雌性 BALB/c 小鼠，随机分为对照组、同型对照组和中性粒细胞耗竭组，每组 15 只。后两组小鼠足底注射含 2×107个 F. monophora 分生孢子的真菌溶液 50μL，对照组注射等量 PBS 。实验期间定期测量足垫厚度评估炎症，在不同时间点处死小鼠，收集足垫样本进行菌落形成单位（colony-forming unit，CFU）计数、组织病理学检查和细胞因子测量。
采用 1A8（anti-Ly6G）抗体进行中性粒细胞耗竭，在真菌感染前 24 小时腹腔注射 100μg，之后每隔一天腹腔注射 25μg 或 50μg 维持中性粒细胞耗竭状态 。同型对照组注射等量同型对照抗体，PBS 组注射等量 PBS。通过尾静脉采血，利用流式细胞术检测血液中中性粒细胞水平，确认中性粒细胞耗竭效果。
通过 CFU 计数测量真菌负荷，将小鼠足垫切除、称重、匀浆后，进行系列稀释，接种于含 0.2M 头孢噻肟钠的 PDA 平板，26°C 培养 7 天计数菌落 。足垫组织经 10% 福尔马林固定、石蜡包埋、切片，进行苏木精 - 伊红染色（hematoxylin-eosin staining，H&E）或过碘酸希夫染色（periodic acid-Schiff，PAS），扫描切片用于分析。
足垫样本保存在含蛋白酶抑制剂鸡尾酒的 PBS 中，匀浆、离心后，使用 Cytokine & Chemokine 26-Plex Mouse ProcartaPlex 试剂盒检测中性粒细胞相关趋化因子（GM-CSF、CXCL1、CXCL2 和 CCL3）和炎症细胞因子（IL-17A、TNF-α、IL-1β、IL-6 和 IL-10） 。
利用 PolymorphoPrep 密度梯度介质从健康个体外周血中分离中性粒细胞，通过瑞士吉姆萨染色或流式细胞术检测纯度 。将中性粒细胞与 F. monophora 分生孢子、菌丝片段或硬化细胞共培养，以佛波酯（PMA）或白色念珠菌（C. albicans）为阳性对照，未刺激的中性粒细胞为阴性对照。通过共聚焦显微镜和扫描电子显微镜观察 NETs 形成，使用 PicoGreen 检测游离双链 DNA（dsDNA）定量 NETs。
实验数据以均值 ± 标准误（SEM）表示，采用非配对双尾 Student's t 检验和单因素方差分析（one-way ANOVA）进行统计分析，P < 0.05 为差异具有统计学意义。
3 结果
经 1A8 抗体处理后，小鼠外周血中中性粒细胞（CD11b+Ly6G+）占 CD45+白细胞的比例降至 0.04%，成功构建中性粒细胞耗竭模型，为后续实验奠定基础。
在感染后 7、14 和 21 天，同型对照组足垫中 F. monophora 的 CFU 值显著低于中性粒细胞耗竭组 。PAS 染色结果显示，中性粒细胞耗竭组足垫中 F. monophora 的数量和形态变化趋势与 CFU 值一致，该组在感染早期有更多的孢子和菌丝，且出现短菌丝簇和硬化样结构，表明中性粒细胞在控制 F. monophora 感染和限制其萌发中起重要作用。
中性粒细胞耗竭组和同型对照组感染 F. monophora 后足垫均出现炎症反应，但中性粒细胞耗竭组足垫肿胀更严重，持续时间更长 。组织病理学分析显示，中性粒细胞耗竭组炎症细胞浸润更广泛、更持久，且炎症中心有大量中性粒细胞碎片，周围主要是巨噬细胞，淋巴细胞浸润较少，说明中性粒细胞耗竭会导致免疫反应不完整，加重感染程度和持续时间。
中性粒细胞耗竭组足垫中，3 - 7 天 GM-CSF、CXCL1 和 CXCL2 等中性粒细胞趋化因子水平升高，可能是对中性粒细胞破坏的代偿反应 。同时，IL-1β、IL-6、CCL3 和 TNF-α 等巨噬细胞相关细胞因子高表达，与巨噬细胞增多相符。Th1/Th2 或 Th17 相关的促炎细胞因子 IFN-γ、IL-4 和 IL-23 水平降低，而 IL-17 水平升高，这与淋巴细胞减少和中性粒细胞耗竭的代偿机制有关。
在同型对照组感染小鼠足垫中，感染后 1 - 3 天可观察到 NETs 形成，3 天最明显，7 天消失 。体外实验中，F. monophora 分生孢子不能诱导外周血中性粒细胞形成 NETs，而短菌丝和硬化细胞可诱导明显的 NETs 形成，且短菌丝和硬化细胞刺激的中性粒细胞释放大量细胞外 DNA，表明 F. monophora 诱导 NETs 形成具有形态依赖性。
4 讨论
中性粒细胞在固有免疫中作用多样，既能发挥促炎和抗菌功能，部分也有抗炎作用，参与炎症消退和组织修复 。本研究通过构建中性粒细胞耗竭小鼠足垫 F. monophora 感染模型，结合体外共培养实验，深入探究了中性粒细胞在 CBM 中的作用。
研究发现，中性粒细胞在清除 F. monophora 中起关键作用，中性粒细胞耗竭小鼠足垫中真菌清除能力显著受损，病程延长，证实了中性粒细胞在 CBM 中作为抗真菌效应细胞的作用 。与其他研究中中性粒细胞不利于宿主清除 F. pedrosoi 的结论不同，可能是由于实验采用的小鼠感染模型或真菌菌株不同。
NETs 在捕获、杀死和降解病原体方面发挥重要作用 。本研究中，小鼠足垫感染 F. monophora 分生孢子早期仅观察到少量 NETs，体外实验中分生孢子不能诱导 NETs 形成，而短菌丝和硬化细胞可诱导 。这表明 F. monophora 诱导 NETs 形成依赖其形态，分生孢子不能诱导 NETs 形成可能是其免疫逃逸策略，有待进一步研究。体内外 NETs 形成差异可能与体内外环境不同有关。
真菌病原体的形态转变是其入侵宿主的重要适应机制 。本研究发现中性粒细胞能有效抑制 F. monophora 分生孢子向菌丝和硬化样细胞的转变。在 CBM 中，病原体转变为硬化细胞可增强免疫逃逸能力，导致疾病慢性化和难治性 。目前对中性粒细胞抑制 CBM 病原体形态转变的研究较少，本研究为深入了解 CBM 发病机制提供了新证据。
中性粒细胞耗竭小鼠对 F. monophora 的炎症反应更强烈，促炎细胞因子和趋化因子水平升高，炎症细胞大量涌入 。巨噬细胞相关细胞因子升高，提示巨噬细胞在中性粒细胞耗竭小鼠中可能起主要的真菌清除作用，但巨噬细胞在 CBM 中的抗真菌活性较低。淋巴细胞数量减少与相关细胞因子表达降低有关，表明中性粒细胞减少会损害适应性免疫系统功能。此外，GM-CSF、CXCL1 和 CXCL2 等趋化因子水平升高以及 IL-17A 水平的意外升高，可能是对中性粒细胞耗竭的代偿反应。
本研究存在一定局限性。中性粒细胞耗竭模型依赖抗体介导，可能存在脱靶效应或不完全耗竭；小鼠模型也无法完全模拟人类 CBM 的慢性特征和组织特异性反应 。因此，需要进一步优化模型，以更好地理解人类 CBM 的发病机制。
综上所述，本研究成功构建中性粒细胞耗竭的 F. monophora 足垫感染模型，证实中性粒细胞在 CBM 早期炎症中对真菌清除、缩短病程和减轻炎症反应至关重要，且能抑制真菌形态转变 。这些发现为深入了解 CBM 免疫机制提供了重要依据，也为靶向中性粒细胞反应的 CBM 治疗提供了潜在方向。
