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斑马鱼异种移植模型在预测癌症治疗反应方面潜力巨大，但精确显微注射癌细胞困难重重。研究人员设计并验证了自动化显微注射机器人。该机器人注射成功率约 60%，幼虫存活率超 70%，全自动化模式速度翻倍，为药物研发和患者诊断带来新契机。
在生命科学的奇妙世界里，斑马鱼（Danio rerio）逐渐成为研究人类疾病的得力助手，尤其是在癌症研究领域。斑马鱼幼虫体积小、产量高、身体透明，对异种移植有较好的耐受性，只需少量细胞就能进行移植，而且移植的癌细胞能快速生长，这些优势让斑马鱼异种移植模型成为研究肿瘤行为的热门选择。通过将人类细胞移植到斑马鱼幼虫体内（即异种移植），科学家们能够在活体环境中动态观察肿瘤的形成、迁移、转移等过程，为攻克癌症提供了宝贵的线索。
然而，这一模型的推广却遭遇了 “拦路虎”。精确地将癌细胞显微注射到众多微小且脆弱的斑马鱼幼虫体内，是一项极其艰巨的任务。传统的手动显微注射系统，需要研究人员使用立体解剖显微镜、基于气压的显微注射器和显微操作器进行操作。但 2 天受精后（2 dpf）的斑马鱼幼虫实在太小，体长约 3.7 毫米，宽仅 0.6 毫米，这就要求注射针的针尖极小，同时还要精准地瞄准特定的注射部位，避免对幼虫造成明显损伤。这不仅需要研究人员经过大量的培训和练习，耗费大量时间，而且实验结果还容易受到研究人员技能水平、认知能力、操作流程理解差异以及环境条件等因素的影响，导致实验结果的可重复性差。这些问题严重限制了斑马鱼异种移植模型在临床诊断和药物研发中的广泛应用。
为了突破这些困境，来自多个国家研究机构的科研人员，包括 Life Science Methods BV（荷兰莱顿）、Centre for Molecular Medicine Norway（挪威奥斯陆）等，共同开展了一项重要研究。他们设计、制造并验证了一种自动化显微注射机器人，相关研究成果发表在《npj Biomedical Innovations》上。
研究人员为了实现斑马鱼幼虫的自动化显微注射，采用了一系列先进的技术方法。在硬件设计方面，精心打造了一套结构复杂且精密的机器人系统。该系统配备了多个不同功能的摄像头和镜头，如顶部的高分辨率 10× 远心镜头搭配 Optotune 液体镜头，用于清晰观察注射过程；底部的低分辨率摄像头结合 0.5× 远心镜头，便于检测后续待注射的斑马鱼幼虫。同时，还设置了多种光源，像圆顶光提供高数值孔径（NA）照明，增强表面聚焦；同轴光则利用底部镜头输入，产生平行的低 NA 光，增加景深，以便更好地观察斑马鱼的内部结构，比如血流情况。在软件算法上，运用深度学习技术对大量斑马鱼幼虫和注射部位的图像进行标注和训练。利用 U - Net 网络进行图像分割，识别幼虫的各个部位和注射部位；采用 Inception v3 网络检测皮肤穿刺时刻，从而实现机器人对注射过程的精准控制。
下面来看看具体的研究结果：
- 注射机器人的设计概述：设计的机器人系统由多个关键组件构成，从顶部的成像系统到底部的检测系统，各部分协同工作。通过摄像头和镜头的配合，能从不同角度清晰观察注射过程，多种光源的设置进一步优化了成像效果。操作人员可通过触摸屏幕进行系统操作和实时观察注射过程，整个机器人设计紧凑，尺寸为 42×50×42 cm（宽 × 高 × 深），方便在实验室中使用。
- 机器人注射过程和穿刺检测：注射过程分为注射设置、针校准、液滴校准、板选择和注射五个步骤。在注射设置中，研究人员可以根据需求选择不同的发育阶段、注射部位、注射位置和角度等参数。在全自动模式下，机器人会自动扫描琼脂糖板，定位幼虫并完成注射；在半自动模式下，机器人定位幼虫后，研究人员可手动控制注射针进行注射。为了让机器人准确识别斑马鱼幼虫，研究人员收集并标注了数千张图像，训练机器学习模型。在注射过程中，机器人通过监测针尖周围标记锚点的运动来检测皮肤穿刺，当皮肤穿刺时，锚点会出现较大幅度的移动，以此判断穿刺成功，进而启动注射操作。
- 向斑马鱼幼虫的库维尔管（DoC）注射：库维尔管是斑马鱼幼虫的主要静脉结构，能将注射物质直接输送到血液中。研究人员在多个实验室，将多种物质，如染料、肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）、人类膀胱癌细胞系 UM - UC - 3、微球和人类乳腺癌细胞系 MDA - MB - 231 等，注射到 2 dpf 斑马鱼幼虫的 DoC 中进行验证。结果显示，机器人注射的成功率较高，全自动模式下注射时间明显缩短，平均每只幼虫注射时间为 43 秒，约为手动注射（84 秒）的一半，在相同时间内可注射的幼虫数量翻倍。虽然机器人注射的存活率略低于手动注射，但主要是由于 UM - UC - 3 细胞注射数据中的一个异常值导致。总体而言，机器人两种注射模式的平均成功率（63% 和 71%）高于手动注射（56%）。
- 向斑马鱼幼虫的卵黄周隙（PVS）注射：卵黄周隙是位于斑马鱼幼虫表皮和卵黄合胞体层之间的无血管区域，适合研究肿瘤的迁移、转移行为和新血管形成。研究人员训练机器人识别 PVS 结构，使用 MDA - MB - 231 细胞等多种癌细胞和临床样本进行注射验证。在自动和半自动注射模式下，都能将癌细胞有效输送到 PVS 中。半自动模式的平均注射成功率（60%）与手动方法（63%）相当，全自动模式成功率相对较低（45%），但注射时间只有手动的一半，在相同时间内可注射更多幼虫，一定程度上弥补了成功率低的问题。三种注射方法的存活率相似。
- 向斑马鱼幼虫的后脑脑室注射：斑马鱼幼虫的后脑位于中脑后方、脊髓前方，是研究脑肿瘤细胞原位植入和肿瘤脑转移的常用部位。研究人员对 2 dpf 斑马鱼幼虫的后脑边界进行标注和训练，使机器人能自动定位注射针。将人类 GFP 标记的 H3K27M 突变弥漫中线胶质瘤（DMG）细胞系（SU - DIPG - XIII - P*）注射到后脑脑室后，细胞能在脑室中定位。全自动模式下，机器人检测到幼虫边缘后会自动完成注射；半自动模式下，研究人员可根据需要灵活调整。全自动模式的注射速度约为半自动模式和手动注射的两倍，虽然成功率略低于后两者，但在存活率方面，三种注射模式在 24 小时后都较高（90 - 95%）。
综合上述研究结果，研究人员开发的斑马鱼幼虫显微注射机器人，为斑马鱼异种移植模型的应用带来了新的突破。该机器人可在全自动或半自动模式下工作，能高效、准确地将各种物质和癌细胞注射到斑马鱼幼虫的特定部位。其注射成功率和幼虫存活率与手动注射相当，且全自动模式速度更快，大大提高了实验效率。这一成果不仅减少了对专业人员的依赖，降低了实验操作难度，还增强了实验的可重复性，为大规模开展斑马鱼异种移植研究提供了有力支持。
在癌症研究领域，斑马鱼异种移植模型有着广阔的应用前景。通过将患者的肿瘤细胞移植到斑马鱼幼虫体内，能够快速评估药物疗效，为个性化治疗方案的制定提供依据。例如，对于 H3K27M 突变的弥漫中线胶质瘤（DMG）患者，目前的治疗手段效果不佳，而利用该机器人将相关癌细胞注射到斑马鱼后脑脑室，为筛选新型药物和联合治疗方案提供了新的途径。此外，该机器人还具有广泛的适用性，不仅可用于不同类型肿瘤细胞的研究，还能拓展到其他领域，如传染病研究、化合物筛选和毒理学检测等。未来，随着技术的不断改进和优化，有望进一步提高注射成功率和速度，为生命科学和健康医学研究带来更多突破，推动精准医学的发展，让更多患者受益。
研究中用到的主要关键技术方法包括：设计制造包含多种摄像头、镜头和光源的自动化显微注射机器人硬件系统；运用深度学习技术，利用 U - Net 网络进行图像分割识别幼虫及注射部位，采用 Inception v3 网络检测皮肤穿刺；以野生型 ABTL、透明 Casper 和 Tg (Fli: GFP) Casper 等斑马鱼品系的 2 dpf 幼虫为主要实验对象开展研究。
