“生死抉择” 的引导编辑：肺炎链球菌基因组工程的新突破

在细菌基因组编辑领域，传统方法复杂且 prime editing 应用受限。研究人员开展肺炎链球菌 make-or-break prime editing（mbPE）研究。结果显示 mbPE 高效精准，可实现多种编辑。这为细菌基因组编辑提供新方法，助力相关研究。

　　在生命科学的微观世界里，基因组编辑技术一直是探索生命奥秘、攻克疾病难题的有力武器。CRISPR-Cas9 技术的出现，更是为基因组编辑带来了革命性的变化，它能够精确地引入 DNA 双链断裂（DSBs），让科学家们对基因的操作更加得心应手。然而，在细菌基因组编辑这个领域，问题却接踵而至。传统的基于 CRISPR-Cas9 的细菌基因组编辑是一个复杂的多步骤过程，需要供体 DNA 模板来修复 DSBs，这无疑增加了实验的难度和成本。而 prime editing 虽然具有独特的优势，比如它不需要引入 DSBs，降低了染色体重排的风险，且修复模板间接包含在引导编辑向导 RNA（pegRNA）中，但在细菌基因组编辑中的应用却并不广泛，可能是由于引入 PE2 介导的突变时选择效率有限，或者对特定遗传背景有要求。正是在这样的困境下，为了寻找更高效、更精准的细菌基因组编辑方法，来自瑞士洛桑大学（University of Lausanne）和中国深圳大学医学院的研究人员携手展开了深入研究。
他们将研究聚焦于肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）这一机会性人类病原体，致力于开发一种新的编辑技术。最终，他们成功开发出了 make-or-break Prime Editing（mbPE）技术，这一成果发表在《Nature Communications》上，为细菌基因组编辑领域带来了新的曙光。

研究人员在开展这项研究时，运用了多种关键技术方法。首先是 Golden Gate Assembly 技术用于 pegRNA 的克隆，它能够高效地构建包含不同序列的 pegRNA 文库。其次，通过诱导实验来检测 PE2 和 mbPE^S.pn的活性，在不同浓度的 aTc 诱导下观察细菌的生长和编辑效果。同时，利用荧光素酶活性测定和 Nano-glo 双荧光素酶测定等方法来评估编辑效率和蛋白质 - 蛋白质相互作用。此外，还运用了测序技术，包括 Illumina 测序和 PacBio HiFi 测序，对编辑位点和基因组进行分析，以确定编辑的准确性和是否存在脱靶效应。

下面来看看具体的研究结果：

• 肺炎链球菌中的引导编辑：研究人员首先尝试在肺炎链球菌中建立实用的引导编辑系统，聚焦于 PE2。他们通过一系列构建和优化，设计了 pegRNA 载体并进行克隆。实验发现，诱导 PE2^S与靶向 pegRNA 结合，虽编辑效率相对较低（约 2% - 3%），但能在肺炎链球菌中实现插入和突变，且肺炎链球菌可耐受并修复单链 DNA 断裂。
• 肺炎链球菌中的 mbPE：研究人员推测引入 DSB 的 prime editing（即 mbPE）在缺乏 NHEJ 的细菌中也可能发挥作用。于是他们构建了相关菌株，实验结果令人惊喜，诱导 mbPE^S.pn后，虽会导致细菌生长缺陷，但存活菌落中约 93% 显示出正确的荧光素酶表型，经测序验证编辑准确，且该过程不依赖 RecA。
• 可扩展的 pegRNA 文库构建：为探索 mbPE 的潜力，研究人员构建了针对 luc 的 pegRNA 文库。通过实验分析，发现 mbPE 能够高效地实现各种碱基对替换，包括单碱基对和多碱基对替换，且编辑效率与突变位置和 pegRNA 结构相关。
• 高效的 DNA 插入和缺失：研究表明 mbPE 在选择含点突变的克隆方面非常有效。进一步研究发现，mbPE 可实现 DNA 插入和缺失，插入长度可达 52 bps，删除长度可达 127 bps，但编辑效率会随插入或删除长度的增加而降低。
• pegRNA 设计规则：通过筛选不同 RTT 和 PBS 长度的 pegRNA 文库，研究确定了在肺炎链球菌中引入单个腺嘌呤核苷酸插入时，理想的 PBS 和 RTT 长度分别为 16 nts 和 15 nts，为 pegRNA 设计提供了重要指导。
• 探索编辑距离：研究发现 mbPE 能在距 PAM 位点 91 bp 的位置进行编辑，虽效率随距离增加而降低，但证明了在远离 PAM 位点处编辑的可能性。
• mbPE 引入 split - luc 标签：研究人员利用 mbPE 将 split luciferase 标签引入肺炎链球菌基因组，验证了 PBP1a 与 MpgA 和 RodZ 的相互作用，为研究肺炎链球菌细胞生物学提供了新视角。
• 顺序基因组编辑：研究人员构建了不同抗生素抗性标记的 pegRNA 克隆载体，实现了肺炎链球菌的顺序基因组编辑，为加速遗传工程项目提供了有效手段。

在研究结论和讨论部分，mbPE 的优势十分显著。它是一种高效的细菌基因组编辑系统，利用 Cas9 核酸酶与逆转录酶融合，结合肺炎链球菌的高重组潜力，通过不依赖 RecA 的机制将 pegRNA 编码的编辑整合到基因组中。与真核细胞中基于核酸酶的引导编辑系统相比，mbPE 产生的非预期副产物更少。通过优化 pegRNA 设计，mbPE 能够实现多种类型的基因编辑，包括点突变、插入、缺失和顺序编辑。然而，mbPE 也存在一些局限性，如实际编辑效率通常低于 5%，限制了多重基因组编辑；插入和缺失长度有限。未来，通过改进逆转录酶、优化 pegRNA 设计、去除某些宿主因子以及使用具有不同 PAM 要求的 Cas9 变体等方法，有望进一步提升 mbPE 的性能，实现更高效、更精准的基因组编辑。
总的来说，mbPE 系统为肺炎链球菌的基因组编辑提供了强大的工具，有助于深入研究肺炎链球菌的细胞生物学，推动相关疾病治疗方法的创新。同时，该研究的方法和思路也为开发其他细菌的 mbPE 系统提供了宝贵的参考，在生命科学和健康医学领域具有重要的意义和广阔的应用前景。