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为准确评估马铃薯受 Pectobacterium atrosepticum 侵染后相关基因表达水平，研究人员开展筛选稳定参考基因的研究。通过多种算法分析 7 个候选基因，发现 EF1α 稳定性最高。这为后续研究抗病基因筛选及机制探索提供标准化参考。
在农业领域，马铃薯是一种极其重要的农作物，然而，它却长期遭受着各种病害的威胁。其中，由 Pectobacterium atrosepticum 引起的马铃薯黑胫病，堪称马铃薯种植和储存过程中的一大 “杀手”。这种病害一旦爆发，会严重破坏马铃薯的生长和发育进程。在发病初期，幼苗生长就会受到阻碍，节间变得短而粗，叶片也会出现褶皱、卷曲的现象，茎基部组织还会呈现出特征性的黑化；随着病情的不断发展，马铃薯植株的维管束组织会被堵塞，导致整株植物出现枯萎症状，最终走向死亡。在储存期间，黑胫病还会让马铃薯块茎大量腐烂，极大地影响了马铃薯的产量和品质，给广大种植户带来了严重的经济损失。
为了深入了解马铃薯抵抗黑胫病的分子机制，找到有效的防治方法，研究人员需要准确分析马铃薯在受到 Pectobacterium atrosepticum 侵染后，相关抗病基因的表达变化情况。而这一分析过程高度依赖于实时荧光定量 PCR（RT-qPCR）技术。RT-qPCR 虽然具有高效、准确、经济且操作简便等优点，能够检测不同浓度的 RNA，适用于多种类型的样本，但它的结果准确性很大程度上取决于所选择的内参基因。合适的内参基因就像是一把精准的 “尺子”，可以帮助研究人员准确衡量目标基因的表达水平。然而，不同的实验条件和样本特性，会使内参基因的表达稳定性受到影响。之前在这方面的研究还比较有限，因此，筛选出在马铃薯受 Pectobacterium atrosepticum 侵染时稳定表达的内参基因，就显得尤为重要。
来自青海大学农林科学院和青海省农业有害生物综合治理重点实验室的研究人员勇挑重担，开展了一项极具价值的研究。他们的研究成果发表在《Scientific Reports》上，为马铃薯抗黑胫病的研究提供了重要的参考依据。
在这项研究中，研究人员运用了多种关键技术方法。首先是样本处理技术，他们选取了致病菌株 P. atrosepticum 以及抗病品种青薯 9 号和易感品种乐薯 1 号，在马铃薯植株长到一定高度后进行接种处理，并在接种后的 1 天、3 天和 5 天分别采集样本。接着是核酸处理技术，从样本中提取总 RNA 并反转录为 cDNA，用于后续实验。然后是引物设计与扩增技术，通过搜索相关数据库和文献，筛选出 7 个候选参考基因（EF1α、eIF5A3、Tubulin、Ubiquitin、GAPDH、Actin 和 CYP3），设计并合成特异性引物，进行 qRT-PCR 扩增，构建标准曲线并分析扩增效率。最后，利用 geNorm、NormFinder、BestKeeper、ΔCt 和 RefFinder 等多种算法软件，对候选参考基因的表达稳定性进行综合评估。
下面来看看具体的研究结果：
- 总 RNA 质量评估：通过 2% 琼脂糖凝胶电泳分析，发现两个马铃薯品种样本的 28S 和 18S rRNA 条带清晰可辨，表明 RNA 没有明显降解，保证了后续实验的可靠性。
- 候选参考基因引物特异性和扩增效率：设计的引物在常规 PCR 和 RT-qPCR 扩增中均表现良好，扩增出单一且符合预期长度的条带，熔解曲线呈现单峰，无特异性扩增现象。并且，7 对引物的扩增效率均超过 100%，决定系数（R2）超过 0.990，说明引物特异性强，适合进一步实验。
- 候选参考基因 Ct 值表达：RT-qPCR 扩增结果显示，不同候选参考基因的 Ct 值范围不同。其中，EF1α 的 Ct 值最稳定，变化最小；Ubiquitin 的 Ct 值变化最大。这初步表明 EF1α 可能是一个较为稳定的参考基因，而 Ubiquitin 的稳定性较差。
- 表达稳定性分析
- GeNorm 分析：该软件计算出的稳定性值（M 值）显示，所有候选基因的 M 值均低于 1.5，说明 7 个参考基因表达都比较稳定。在不同接种时间点和所有样本综合分析中，GAPDH、Actin 和 EF1α 在不同情况下分别表现出较高的稳定性，而 Ubiquitin 最不稳定。通过成对变异分析确定，纳入两个参考基因就能为可靠的 RT-qPCR 提供足够的标准化稳定性。
- BestKeeper 分析：根据计算基因表达水平的标准差（SD）和变异系数（CV），EF1α 稳定性最高，Tubulin 和 eIF5A3 次之，Ubiquitin 和 GAPDH 稳定性较差。这进一步证明了 EF1α 在本研究中的可靠性。
- NormFinder 分析：该软件评估的结果显示，不同时间点和所有样本中，EF1α 和 Tubulin 总体较为稳定，GAPDH 和 Ubiquitin 稳定性较差。且该分析结果与 GeNorm 分析存在一定差异。
- ΔCt 分析：以平均标准差对候选参考基因进行排名，EF1α 在 1 天接种后最稳定，eIF5A3 在 3 天接种后最稳定，Actin 在 5 天接种后最稳定，总体上 EF1α 最稳定，Ubiquitin 最不稳定。该结果与其他几种分析方法基本一致，但也存在一些差异。
- RefFinder 分析：综合四种分析方法，EF1α、eIF5A3 和 Tubulin 可作为评估不同马铃薯样本基因表达水平的参考基因。
- 参考基因验证：研究人员以 EF1α 和 Ubiquitin 分别作为参考基因，对植物 - 病原体相互作用途径中的四个关键基因（RBOHC、WRKY24、MPK3 和 CPK32）进行 RT-qPCR 分析。结果发现，以 EF1α 为参考基因时，这四个基因的表达水平与 RNA-seq 数据中的 log?倍变化更为相似；而以 Ubiquitin 为参考基因时，表达水平差异较大。这充分验证了 EF1α 作为参考基因的可靠性和稳定性。
研究结论和讨论部分指出，本研究通过多种算法对 7 个候选参考基因在马铃薯受 Pectobacterium atrosepticum 侵染后的表达稳定性进行了全面评估，最终确定 EF1α 是最稳定的参考基因。这一结果为后续准确研究马铃薯与 P. atrosepticum 相互作用过程中抗病基因的表达水平，筛选抗病基因以及深入探索抗病机制，提供了标准化的参考依据。同时也再次强调了在进行 RT-qPCR 实验时，综合运用多种分析工具筛选合适参考基因的重要性。因为不同的分析软件由于算法不同，各有优缺点，仅依靠单一软件可能无法全面、客观地评估候选参考基因。本研究成果对于推动马铃薯抗黑胫病的研究具有重要的意义，为提高马铃薯的产量和品质，保障农业生产的可持续发展奠定了坚实的基础。
