创新方法精准定位低序列复杂性蛋白结构域中关键区域，解锁细胞奥秘

本文聚焦低序列复杂性蛋白结构域（LCD），开发出一种简单分子生物学方法，可定位其自缔合、相分离关键区域，以 TDP - 43 蛋白为例精准锁定关键序列，有助于理解相关疾病机制，推动该领域从实验向计算机模拟发展。

　　

研究背景

多数蛋白质通过独特构象发挥功能，其三维结构由氨基酸线性序列编码。但几十年前发现，部分蛋白质序列无法折叠成稳定结构，如 Gal4 和 VP16 转录因子的激活域。后来研究表明，真核生物蛋白质组中存在大量低序列复杂性蛋白结构域（LCD），也被称为内在无序结构域（IDR）或朊病毒样结构域（PLD）。大部分 LCD 要么无法折叠成稳定三维结构，要么仅在与其他有序大分子相互作用时才折叠。

LCD 的生物学功能引起了广泛关注。研究发现，一些 LCD 可通过自缔合发生相分离，如核孔蛋白富含苯丙氨酸 - 甘氨酸的 LCD 和 FUS RNA 结合蛋白富含酪氨酸 - 甘氨酸的 LCD 能相分离形成水凝胶状状态，此过程涉及不稳定交叉 -β 聚合物的形成。可通过硫代黄素 - T（ThT）依赖的聚合增强荧光或观察球形蛋白液滴形成（液 - 液相分离，LLPS）来检测 LCD 自缔合。

此外，LCD 自缔合与疾病相关。小的自缔合区域常与致病突变共定位，致病突变会改变蛋白质结构，影响自缔合平衡。同时，多种翻译后修饰也发生在 LCD 的交叉 -β 形成区域，调节自缔合平衡，且 75% 的翻译后修饰发生在 LCD 组成的蛋白质组亚群中。以中间丝（IF）蛋白的无序头部结构域为例，其通过弱退火交叉 -β 结构自缔合，在 IF 组装中发挥重要作用，头部结构域的磷酸化可触发丝状体解聚和细胞形态改变。

为深入了解 LCD 在细胞结构组装和调控中的作用，需精准定位其介导瞬时退火的区域。本研究借鉴 Hecht 等人的方法，开发了一种简单的分子生物学方法，用于定位 LCD 中介导自缔合、相分离和生物学功能的交叉 -β 形成区域，该方法对研究 LCD 功能具有重要意义。

实验方法

1. 质粒构建：将编码 TDP - 43 LCD（残基 262 至 414）的 DNA 序列亚克隆到带有 N 端 His 标签的 pHis - parallel 载体中。把编码 TDP - 43 LCD 中 30 个氨基酸残基片段（片段 1 至 12）的 DNA 片段，利用 BamHI 和 XhoI 限制性内切酶位点，亚克隆到 pHis - parallel - GFP - GDEVD 载体中。通过定点突变技术，生成 His - TDP - 43 LCD、GFP - TDP - 43 片段 6（F6）和 GFP - TDP - 43 片段 7（F7）的脯氨酸变体。
2. 蛋白表达与纯化：在大肠杆菌 BL21 (DE3) 细胞中表达 His - TDP - 43 LCD 野生型（WT）和突变体，37°C 条件下，用 1 mM 异丙基 -β - D - 硫代半乳糖苷（IPTG）诱导 3 小时。收获细胞沉淀后，在含有 50 mM Tris（pH 7.5）、6 M 盐酸胍和 20 mM 咪唑的缓冲液中进行裂解，采用超声处理（总时长 3 分钟，超声 10 秒、间隔 30 秒交替进行）。25,000 RPM 离心 30 分钟去除细胞碎片，将澄清的上清液加载到填充有 Ni - NTA 树脂（Gold Bio）的重力柱上。用裂解缓冲液洗涤树脂，去除非特异性结合的蛋白质，再用含有 50 mM Tris（pH 7.5）、6 M 盐酸胍和 300 mM 咪唑的缓冲液洗脱目标蛋白。将洗脱的蛋白浓缩至 1 mM，使用 Slide - A - Lyzer MINI 透析单元（Thermo Scientific，69552）在 4°C 条件下，对含有 10 mM Tris（pH 7.5）、6 M 盐酸胍和 1 mM EDTA 的储存缓冲液进行透析，完成缓冲液交换。利用 Nanodrop 分光光度计和 BCA 测定法确定蛋白浓度。进行液滴形成实验和 ThT 荧光动力学实验时，用储存缓冲液将蛋白浓度调整至 600 μM。
3. 液滴形成与 OD_600nm测量：将 His - TDP - 43 LCD WT 及其变体（600 μM，溶解于 6 M 盐酸胍中）用多通道移液器稀释 30 倍至液滴形成缓冲液中。取 40 μL 所得溶液转移至 384 孔板（Greiner Bio - One，781091）。孵育 5 分钟后，使用酶标仪测量 600 nm 处的吸光度。进行液滴形成成像时，样品孵育 1 小时，利用 Bio - Rad ZOE 荧光细胞成像仪采集图像。
4. ThT 荧光动力学实验：将 His - TDP - 43 LCD WT 及其变体（600 μM，溶解于 6 M 盐酸胍中）稀释到 ThT 缓冲液中，该缓冲液含有 50 mM MES（pH 6.8）、150 mM NaCl、1 mM EDTA、40 μM ThT 和 0.05% NaN₃，最终蛋白浓度调整为 20 μM。将所有 ThT 样品以 40 μL / 孔的体积分配到 384 孔微孔板（Greiner Bio - One，781091）中，用箔膜密封微孔板以防蒸发。在室温下，以 450 nm 为激发波长、485 nm 为发射波长监测 ThT 荧光。每次读取荧光前，振荡微孔板 10 秒，确保样品均匀。
5. GFP 抑制实验：按照标准热激转化方案，将编码 N 端 GFP 标记的 TDP - 43 片段及其突变体的质粒转化到 BL21 (DE3) 感受态细胞中。转化后的细胞在 37°C 摇床中孵育 40 分钟，随后接种到含有 0.5 mL LB 培养基（添加 100 μg/mL 氨苄青霉素和 40 μM IPTG）的 96 DeepWell 板（Fisher，12566612）中。用 Constar 6570 密封胶带密封微孔板，在 37°C 振荡培养过夜。孵育结束后，离心收集细胞，用 PBS 洗涤一次，再重悬于 1 mL PBS 中。测量活大肠杆菌细胞中 GFP 荧光强度的同时测量浊度，因为在合适的细胞密度下，二者呈线性相关。将大肠杆菌悬液进行系列稀释，使用透明 96 孔板（NEST，701011，每孔 100 μL）和酶标仪，测量浊度（600 nm 处吸光度）和 GFP 荧光强度（激发 / 发射 = 488 nm/513 nm）。利用 GraphPad 软件将所得数据拟合成线性回归曲线，记录野生型和双脯氨酸变体曲线的斜率，并将其标准化为野生型值进行比较。
6. 细胞培养：HCT116 细胞由 Deepak Nijhawan 博士馈赠，在添加 10% 胎牛血清和 2 mM L - 谷氨酰胺的杜氏改良 Eagle 培养基（DMEM）中培养，所有细胞在 37°C、95% 空气和 5% CO₂的湿润环境中孵育。
7. 慢病毒生产与诱导细胞系的建立：利用 AscI 和 BamHI 限制性酶切位点，将全长 GFP - TDP - 43 WT 及其脯氨酸突变体克隆到强力霉素诱导的 pSPCTRE - Hygro 载体中。将 psPAX2、pMD2.G 和 pSPCTRE - Hygro - GFP - TDP - 43 质粒共转染到 LentiX293T 细胞中。转染 24 小时后更换培养基，72 小时后收集培养基并通过 0.45 μm 注射器过滤器（Millipore，SLHV033RB）过滤。所得慢病毒用于感染 HCT116 细胞，之后用 200 μg/mL 潮霉素进行筛选。
8. 蛋白质提取与 Western 印迹：在 6 孔板中培养表达 GFP - TDP - 43 全长 WT 和双脯氨酸变体的诱导细胞系。孵育 24 小时后，向培养基中添加强力霉素，终浓度为 3 ng/mL。诱导 48 小时后，用 PBS 洗涤细胞两次，在添加蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Roche）和 Benzonase 核酸酶（Novagen）的 RIPA 缓冲液（30 mM Tris，pH 7.4，150 mM NaCl，1% IGEPAL CA - 630，1% 脱氧胆酸钠，0.1% SDS）中裂解细胞，冰上裂解 30 分钟。4°C、21,000×g离心 30 分钟去除细胞碎片，使用 BCA 蛋白测定试剂盒（Thermo Fisher Scientific）测定裂解物中的蛋白浓度。对于每个细胞系，取 10 μg 总蛋白进行 SDS - PAGE 分离，将蛋白质转移到膜上，用兔抗 N 端 TDP - 43（Proteintech，10782 - 2 - AP）和小鼠抗 GAPDH（EMD Millipore，C87727）等一抗进行免疫印迹，二抗使用 HRP 标记的山羊抗兔和 HRP 标记的山羊抗小鼠（Bio - Rad）。利用 ECL Western 印迹底物（Bio - Rad）进行化学发光检测，通过 ChemiDoc Touch 成像系统（Bio - Rad）捕获图像。
9. 免疫细胞化学与共聚焦成像：在 4 孔培养板（BD Falcon，354104）中培养表达 GFP - TDP - 43 全长 WT 和双脯氨酸突变体的诱导细胞系，用 3 ng/mL 强力霉素孵育 48 小时。去除培养基后，用温热的 PBS 洗涤细胞两次，用 4% 多聚甲醛固定 15 分钟。固定后，再用 PBS 洗涤两次，使用添加 DAPI 染料的 Vectashield 封片剂（Vector，H1200）封片。利用配备 63× 油浸物镜的 Zeiss LSM880 显微镜采集共聚焦图像，以 3.5× 放大倍数捕获 0.5 μm 的 Z 轴层叠图像，图像尺寸设置为 1,024×1,024 像素。对于己二醇处理的细胞，在多聚 - D - 赖氨酸包被的培养板（Gibco，A3890401）中培养表达 GFP - TDP - 43 WT 的细胞，用 3 ng/mL 强力霉素孵育 48 小时，然后用 8% 1,6 - 己二醇（Sigma - Aldrich，240117）或 8% 2,5 - 己二醇（Sigma - Aldrich，H11904）处理 5 分钟，再进行洗涤和固定，按照上述参数采集共聚焦图像。使用 Fiji 软件分析 TDP - 43 核斑，对 GFP 阳性细胞核的共聚焦图像进行最大强度 Z 轴投影和平滑处理，提取单个 GFP 阳性细胞核，利用 Image → Adjust → Threshold → Method: Li → Auto → Analyze → Analyze Particles 模块计算其平均荧光强度。将荧光强度超过平均强度 1.6 倍的结构识别为核斑，通过 Process → Binary → Watershed 分离相邻核斑，使用 Analyze → Analyze Particles 自动确定核斑数量。
10. 定量与统计分析：在图和图注中报告统计参数，包括 n 的定义和值、分布及偏差。本研究中统计显著性的测量采用单因素方差分析（One - way ANOVA），在 GraphPad 软件中进行统计分析。

实验结果

1. TDP - 43 LCD 自缔合关键区域的确定：TDP - 43 RNA 结合蛋白的 LCD 从脯氨酸残基 262 延伸至蛋白羧基末端的蛋氨酸残基 414。研究发现，位于残基 321 至 340 之间约 20 个氨基酸的进化保守区域，可通过形成不稳定的交叉 -β 分子结构介导链间自缔合。为定位该区域，采用 GFP 抑制方法，将 TDP - 43 LCD 的 30 个氨基酸片段分别融合到 GFP 的 C 端。通过 SDS - PAGE 和分光光度法检测，发现融合 TDP - 43 LCD 中 311 - 342 残基（片段 6，F6）和 321 - 351 残基（片段 7，F7）的 GFP 融合蛋白荧光显著降低，这两个片段重叠的 20 个氨基酸（321 - 342 残基）正是进化保守区域，且与形成相分离液滴和不稳定交叉 -β 聚合物的关键序列一致。
2. 随机筛选确定 GFP 抑制片段：基于上述发现，构建质粒文库，将对应 TDP - 43 LCD 30 个氨基酸片段的合成寡核苷酸，随机克隆到 GFP 编码序列下游。转化 BL21 (DE3) 细菌细胞后，在含 IPTG 的琼脂平板上培养，通过紫外光下观察菌落荧光筛选。结果显示，含有进化保守交叉 -β 核心区域（311 - 342 或 321 - 351 残基）编码序列的菌落均为暗绿色，而其他 30 个氨基酸片段来源的菌落，要么是亮绿色，要么是亮暗混合色。
3. 突变分析验证关键区域：为验证 β 链结构构象对 GFP 荧光抑制的作用，对 F6 和 F7 片段进行定点突变，将成对的氨基酸替换为脯氨酸，因为脯氨酸不会为多肽主链提供 NH 基团，不利于退火 β 片层的形成。实验结果表明，F6 片段中部分双脯氨酸变体（如 F6 - P3、F6 - P4 等）和 F7 片段中部分变体（如 F7 - P1 至 F7 - P5）可显著提高 GFP 荧光，说明这些变体干扰了片段抑制 GFP 荧光的能力。综合分析确定，从丙氨酸残基 321 到亮氨酸残基 340 的 20 个氨基酸区域，是 TDP - 43 LCD 抑制 GFP 荧光的关键区域，与进化保守的交叉 -β 形成区域一致。
4. 脯氨酸突变对相分离和聚合物形成的影响：研究脯氨酸突变对 TDP - 43 LCD 两种相分离形式的影响。在略酸性 pH 和生理正常单价盐条件下，TDP - 43 LCD 可形成液滴。实验发现，部分双脯氨酸变体（如 F6 - P3、F6 - P4 等）在 150 mM NaCl、pH 6.5 条件下，液滴形成能力受损；在 pH 6.8 时，F6 - P2、F6 - P6 和 F7 - P6 变体的液滴形成减少约 2 倍。同时，对这些蛋白样品进行 ThT 荧光实验检测不稳定交叉 -β 聚合物形成，结果显示，部分变体（如 F6 - P3、F6 - P4 等）的 ThT 荧光增强不明显，而野生型、F6 - P1 和 F7 - P7 变体则有明显的 ThT 荧光增强。这些结果表明，影响 GFP 荧光抑制的脯氨酸变体，同样影响液滴形成和交叉 -β 聚合物组装，且与之前研究中 1,6 - 己二醇对 TDP - 43 LCD 相分离结构的溶解作用相关。
5. 脯氨酸突变对核斑形成的影响：TDP - 43 蛋白主要存在于哺乳动物细胞核中，形成核斑。将上述双脯氨酸变体构建成 GFP 融合蛋白，通过慢病毒感染 HCT116 细胞并诱导表达。Western 印迹检测显示，各变体表达水平与野生型相当。共聚焦显微镜观察发现，部分变体（如 F6 - P3、F6 - P4 等）表达的细胞中，GFP 阳性核斑数量显著减少，而 F6 - P1、F6 - P2 等变体表达的细胞中，核斑数量无明显变化。这表明 TDP - 43 LCD 的自缔合对其组装成核斑至关重要，且与之前实验中影响自缔合的脯氨酸变体结果一致。
6. 两种脂肪醇对 TDP - 43 核斑的影响：研究发现，1,6 - 己二醇（1,6 - HD）比 2,5 - 己二醇（2,5 - HD）更能有效溶解 TDP - 43 形成的核斑。溶液 NMR 研究表明，1,6 - HD 对 TDP - 43 LCD 中 321 - 340 残基区域的主链羰基氧原子化学位移影响更大。用 8% 的 1,6 - HD 或 2,5 - HD 处理表达 GFP - TDP - 43 的 HCT116 细胞 5 分钟后，发现 1,6 - HD 处理组核斑数量减少约 75%，而 2,5 - HD 处理组仅减少 30%，这进一步证实了 TDP - 43 核斑形成依赖于其 LCD 的自缔合，且 1,6 - HD 对自缔合的抑制作用更强。

讨论

本研究开发的方法可有效定位低序列复杂性蛋白结构域中自缔合、相分离和核斑形成所需的区域，有助于分析依赖同源自缔合发挥功能的 LCD。对于 TDP - 43 LCD 片段干扰 GFP 荧光