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本文聚焦神经元自噬，发现其可通过调节兰尼碱受体（RYR）介导的钙激活钾通道（BKCa）功能，控制神经元兴奋性。在自噬缺陷的 ATG5 条件敲除小鼠中，神经元过度兴奋，引发癫痫样放电。这一成果为理解癫痫等疾病机制及治疗提供新方向。
研究背景
自噬（autophagy）是细胞的自我降解过程，对于神经细胞和大脑健康至关重要，尤其在衰老过程中。在有丝分裂后神经元中，自噬引发的降解和自我更新对大脑功能和神经元存活意义重大。自噬缺陷与多种神经退行性疾病相关，如阿尔茨海默病、亨廷顿病和肌萎缩侧索硬化症等。近期研究还发现自噬在调节突触功能和神经元活动方面也有重要作用，不过自噬受损导致癫痫的机制尚不清楚。
研究方法
- 动物模型构建：将 ATG5lox/lox小鼠与 Emx1-Cre 小鼠杂交，获得在兴奋性神经元中条件性敲除 ATG5 的小鼠（ATG5 cKO），用于后续实验。
- 切片制备与处理：对小鼠进行颈椎脱臼处死后取脑，制备脑切片。部分切片用于场电位记录，部分用于全细胞膜片钳记录，还有部分用于记录 γ 振荡和癫痫样放电。实验中使用了多种药物处理，如 RYR 拮抗剂丹曲林（Dantrolene）、BKCa 通道抑制剂伊比利亚毒素（Iberiotoxin）等。
- 电生理记录
- 场电位记录：包括记录 CA1 区的场兴奋性突触后电位（fEPSP）、CA3 区的群体峰电位（PS），以此评估神经元的兴奋性和突触传递功能。
- 全细胞膜片钳记录：在 CA1 锥体细胞中进行，测量神经元的兴奋性、动作电位（AP）相关参数，如 AP 半宽度、超极化后电位（AHP）等。
- γ 振荡和癫痫样放电记录：通过向脑切片中灌注海藻酸（kainate）诱导 γ 振荡和癫痫样放电，记录其频率、幅度等参数。
- 数据分析：使用 SigmaPlot、Matlab、GraphPad Prism 等软件对电生理数据进行分析，采用方差分析（ANOVA）、t 检验、Mann - Whitney U 检验等统计方法评估数据差异的显著性。
研究结果
- 癫痫样放电与神经元兴奋性增加：ATG5 cKO 小鼠海马切片中，海藻酸诱导的癫痫样放电比例显著高于野生型（WT）小鼠，且癫痫样放电的事件间隔（IEI）与 WT 小鼠有显著差异。同时，ATG5 cKO 小鼠的 Schaffer 侧支兴奋性增加，表现为纤维 volley（FV）幅度增大，诱发最大 FV 幅度所需的刺激强度降低。此外，ATG5 cKO 小鼠的配对脉冲易化（PPF）降低，表明其初始释放概率增加。
- RYR 功能上调导致神经元兴奋性增加和释放概率升高：用丹曲林抑制 RYR 功能后，ATG5 cKO 小鼠的 FV 幅度、fEPSP 斜率、PPF 等指标均恢复到 WT 小鼠水平，同时海藻酸诱导的癫痫样放电比例和 γ 振荡频率也恢复到与 WT 小鼠相似的水平，这表明 RYR 功能上调是 ATG5 cKO 小鼠神经元兴奋性增加和释放概率升高的原因。
- ATG5 cKO 小鼠锥体细胞兴奋性增加和 AP 波形改变：ATG5 cKO 小鼠 CA1 锥体细胞在电流注射时产生的 AP 数量显著多于 WT 小鼠，最大 AP 数量也更高。AP 波形分析显示，ATG5 cKO 小鼠的 AP 半宽度缩短，AHP 增加，而静息膜电位（RMP）、AP 阈值和输入电阻在 WT 和 ATG5 cKO 小鼠之间无显著差异。丹曲林处理可使 ATG5 cKO 小鼠的 AP 半宽度和电容恢复到 WT 小鼠水平。
- BKCa 通道过度激活导致 ATG5 cKO 小鼠兴奋性增加和癫痫样放电：应用伊比利亚毒素抑制 BKCa 通道功能后，ATG5 cKO 小鼠的 AP 半宽度增加，AHP 降低，电容恢复到 WT 小鼠水平。同时，伊比利亚毒素显著减少了海藻酸诱导的癫痫样放电，降低了 FV 幅度，恢复了 CA3 区 PS 幅度。蛋白质组学分析和免疫印迹结果表明，ATG5 缺失不影响 BKCa 通道蛋白水平。此外，伊比利亚毒素不能恢复 ATG5 cKO 小鼠的 PPF，说明 BKCa 通道不影响模型中的突触前释放概率。
研究结论
本研究确定了神经元自噬控制神经元兴奋性和癫痫发生的一条通路，即通过 RYR 介导的 BKCa 通道功能调节。ATG5 条件性敲除导致神经元自噬受损，引起 RYR 介导的钙内流增加，进而激活 BKCa 通道，使神经元兴奋性增加并产生癫痫样放电。研究结果为理解自噬受损与神经元兴奋性增加、癫痫发生之间的关系提供了分子机制，也为治疗与自噬受损相关的神经系统疾病，如癫痫和衰老相关的记忆衰退，提供了潜在的治疗靶点和方向。不过，研究存在一定局限性，如未直接记录突触前 BKCa 通道功能，未来研究需要进一步填补这一空白，深入剖析 ATG5 cKO 小鼠锥体细胞兴奋性增加的机制。
