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骨髓纤维化（MF）等骨髓增殖性肿瘤（MPNs）常与 JAK2V617F突变相关，鲁索替尼治疗 MF 疗效有限且会使 JAK2 异常磷酸化。研究人员探究其机制，发现鲁索替尼稳定 JAK2 激活环构象，保护酪氨酸免受磷酸酶作用，还明确 PIM 激酶作用。这为 MPNs 治疗提供新思路。
在血液疾病的世界里，骨髓增殖性肿瘤（MPNs）就像一群捣乱分子，其中常见的真性红细胞增多症（PV）、原发性血小板增多症（ET）和原发性骨髓纤维化（PMF）等，都和 JAK2 基因的一个突变 ——V617F 密切相关。为了对抗这些疾病，医学研究者们研发出了不少 JAK2 抑制剂，鲁索替尼（Ruxolitinib）就是其中的 “明星药物”，它已经获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准，用于治疗 MF 和 PV。
然而，鲁索替尼并非完美无缺。虽然它在临床试验中展现出了一定的效果，比如能缩小脾脏、改善血液学指标，但患者对它的响应持续时间有限，而且它对异常造血克隆的影响也很有限，疾病容易 “卷土重来”。更让人困惑的是，使用鲁索替尼治疗后，JAK2 的激活环酪氨酸（Tyr1007/Tyr1008）不但没有像预期的那样磷酸化水平降低，反而出现了异常的高磷酸化现象。这一奇怪的现象背后隐藏着怎样的秘密呢？为了解开这些谜团，来自德国石勒苏益格 - 荷尔斯泰因大学医学中心等机构的研究人员开展了深入研究，相关成果发表在《Leukemia》杂志上。
研究人员为了探究鲁索替尼介导的 JAK2 异常高磷酸化机制，采用了多种关键技术方法。在细胞实验方面，他们培养了多种细胞系，如表达 JAK2V617F的 Ba/F3 细胞、HEL 细胞等。通过蛋白质免疫印迹（Western blot）技术检测细胞中蛋白质的磷酸化水平，以此观察不同处理条件下 JAK2、STAT5 等蛋白的磷酸化变化。利用免疫沉淀技术，研究蛋白之间的相互作用，比如分析蛋白酪氨酸磷酸酶（SHP - 2）与 JAK2 的结合情况。还运用 RNA 测序（RNA - seq）技术，全面分析细胞在不同处理后的基因表达变化，寻找关键的基因和信号通路。同时，构建了多种 JAK2 突变体，如激酶失活突变体（V617F + K889R）、鲁索替尼不敏感突变体（JAK2V617F + L983F）等，通过对这些突变体细胞的研究，深入剖析鲁索替尼诱导 JAK2 高磷酸化的内在机制。
一、I 型 JAK2 抑制剂促进 JAK1、JAK2 和 TYK2 的异常高磷酸化
研究人员首先对表达 JAK2V617F的 Ba/F3 细胞进行处理，用鲁索替尼处理后发现，STAT5 的磷酸化受到抑制，但 JAK2 激活环 Tyr1007/Tyr1008 的磷酸化却增加了。进一步研究发现，不仅 JAK2V617F，野生型 JAK2（JAK2 - WT）在鲁索替尼处理后也出现了同样的现象。而且，其他 I 型 ATP 竞争性抑制剂（如 fedratinib 和 lestaurtinib）以及新一代的 I 型 ATP 竞争性抑制剂（如 BMS911543 和 momelotinib）处理细胞后，也能观察到 JAK2 激活环 Tyr1007/Tyr1008 的异常激活。在不同细胞系（如 HEL 细胞）中也得到了类似结果，这表明这种现象不是细胞类型特异性的。同时，研究人员还发现，鲁索替尼处理后，JAK1 的激活环 Tyr1022/Tyr1023 以及 TYK2 的激活环 Tyr1054/Tyr1055 也出现了高磷酸化，而 JAK3 的激活环 Tyr980/981 磷酸化水平则下降。这说明 JAK1 和 TYK2 与 JAK2 在这方面表现相似，但与 JAK3 不同。
二、鲁索替尼诱导 JAK2 高磷酸化是一种内在机制
为了探究鲁索替尼诱导 JAK2 高磷酸化的机制，研究人员进行了一系列实验。他们构建了磷酸化缺陷突变体（S523A）和 ATP 结合缺失突变体（K581R），结果发现这些变体和 JAK2V617F一样，在鲁索替尼处理后仍出现 JAK2 激活环的异常高磷酸化和 STAT5 的抑制，这排除了 JH2 结构域催化活性在其中的作用。接着，他们假设鲁索替尼存在时，蛋白酪氨酸磷酸酶可能从活性 JAK2 复合物上解离，导致 JAK2 Tyr1007/Tyr1008 磷酸化增加。但免疫沉淀实验表明，鲁索替尼的存在并没有改变 SHP - 2 与 JAK2 的结合，说明这种假设不成立。研究人员又构建了 JAK2 激酶失活突变体（V617F + K889R）和鲁索替尼不敏感突变体（JAK2V617F + L983F），结果发现激酶失活突变体在鲁索替尼处理后不会导致激活环 Tyr1007/Tyr1008 高磷酸化，而鲁索替尼不敏感突变体在鲁索替尼处理后也无法诱导 JAK2 激活环 Tyr1007/Tyr1008 高磷酸化，且对细胞生长和 STAT5 磷酸化没有抑制作用。这些结果表明，鲁索替尼诱导 JAK2V617F高磷酸化是一种内在机制，需要鲁索替尼与活性构象的 JAK2 结合。
三、鲁索替尼诱导的 JAK2 高磷酸化是由于保护激活环酪氨酸免受磷酸酶作用
研究人员推测，鲁索替尼存在时 JAK2 激活环酪氨酸磷酸化积累是因为磷酸酶对 JAK2 的去磷酸化作用减少。他们用磷酸酶抑制剂（vanadate）和鲁索替尼共同处理表达 JAK2V617F的细胞，发现当磷酸酶活性被阻断时，鲁索替尼不再抑制 STAT5 磷酸化，JAK2 在无鲁索替尼时强烈磷酸化，而在有鲁索替尼时 JAK2 Tyr1007/Tyr1008 磷酸化受到抑制；去除磷酸酶抑制剂后，鲁索替尼介导的 JAK2 激活环 Tyr1007/Tyr1008 高磷酸化又恢复了，这表明磷酸酶参与了这一过程。进一步通过非变性免疫沉淀实验发现，在 ATP 竞争性抑制剂存在时，用识别激活环 Tyr1007/Tyr1008 的磷酸特异性抗体无法免疫沉淀 JAK2，而变性免疫沉淀则可以，这意味着 ATP 竞争性抑制剂存在时，激活环构象在激酶结构域内被稳定，保护了激活环 pTyr1007/Tyr1008 免受磷酸酶作用。
四、激活环构象的不稳定导致激活环磷酸化减少并防止 JAK2 异常高磷酸化
JAK2 的激活环构象受到多种因素影响，其中 Arg975 和 Lys999 等残基对其稳定起着重要作用。研究人员构建了 JAK2V617F + R975A 和 JAK2V617F + K999A 突变体，发现这些突变体在 HEK293T 细胞中表达时，JAK2 Tyr1007/Tyr1008 的磷酸化水平比 JAK2V617F降低，同时 JAK2 的自磷酸化和 STAT5 的磷酸化也减少。用过钒酸钠处理可以挽救这些突变体中 JAK2 的磷酸化，说明这些残基对 JAK2 激活环构象至关重要，激活环构象的不稳定容易受到磷酸酶的作用。而且，这些突变体还导致 Ba/F3 细胞出现因子非依赖生长。用鲁索替尼处理这些突变体后发现，它们不会影响鲁索替尼对细胞生长的抑制作用，但 JAK2V617F + R975A 突变体在低浓度鲁索替尼处理时激活环磷酸化增加（但比 JAK2V617F低），高浓度时减少；JAK2V617F + K999A 突变体则不存在 Tyr1007 和 Tyr1008 残基的高磷酸化，这表明 Tyr1007 与 Arg975、Tyr1008 与 Lys999 的相互作用对鲁索替尼介导的激活环酪氨酸磷酸化稳定至关重要。
五、鲁索替尼解离后高磷酸化的 JAK2 具有高活性
研究人员发现，在表达 JAK2V617F的 Ba/F3 细胞中，当鲁索替尼从活性 JAK2 上解离后，与未接触鲁索替尼的细胞相比，STAT5 在 1 小时后被强烈激活，同时细胞中 STAT5 靶基因（如 c - Myc 和 PIM1）的表达增加，细胞增殖也显著增加。在其他 JAK2V617F阳性的细胞系（如 HEL 和 SET - 2 细胞）中进行鲁索替尼洗脱实验，也得到了类似的结果，即 STAT5 及其靶基因 PIM1、PIM2 被激活，细胞出现过度增殖。
六、高磷酸化的 JAK2 使 JAK2/STAT5 靶基因表达过度激活
通过 RNA 测序分析发现，鲁索替尼处理表达 JAK2V617F的 Ba/F3 细胞 6 小时后，经典的 JAK2 信号通路和 STAT5 靶基因（如 PIM 和 ID1）受到抑制，同时 TGM2、Serpina 3 g、SPP1 和 ACTG1 等基因也下调。而在鲁索替尼处理 1 小时后洗脱的细胞中，STAT5 靶基因 PIM2 和 ID1 以及 MPL 等基因显著上调。对 MPN 患者的 RNA 测序数据分析也发现，接受鲁索替尼治疗的患者中 PIM2 和 MPL 基因显著上调。进一步研究发现，用 PIM 抑制剂 TP - 3654 处理可以显著减少鲁索替尼耐药克隆的数量，说明 PIM 激酶在鲁索替尼耐药中起重要作用。
七、PIM 激酶在鲁索替尼诱导的细胞过度增殖和耐药中起重要作用
通过激酶活性分析发现，鲁索替尼处理会显著影响参与信号转导、免疫系统调节、癌症通路、细胞生长和死亡的激酶。其中，PIM2 等激酶在鲁索替尼处理时受到抑制，而在鲁索替尼恢复 15 分钟后活性增加。在 JAK2V617F表达的 Ba/F3 细胞中过表达 PIM1 和 PIM2，细胞在鲁索替尼洗脱后出现过度增殖，且耐药克隆数量增加；而敲低 PIM1 和 PIM2 则会抑制细胞增殖，减少耐药克隆数量。这表明 PIM 激酶在鲁索替尼诱导的细胞过度增殖和耐药中起重要作用。
综合上述研究结果，研究人员揭示了鲁索替尼介导的 JAK2V617F异常高磷酸化的机制。鲁索替尼与 JAK2 激活环 Tyr1007/Tyr1008 磷酸化后的活性构象结合，稳定激活环构象，通过 Arg975 和 Lys999 等残基保护激活环酪氨酸免受磷酸酶作用，使 JAK2 处于异常高磷酸化但无活性的状态。当鲁索替尼解离后，高磷酸化的 JAK2 会导致 STAT5 和 PIM 激酶的反弹激活，这可能是 MPN 患者接受鲁索替尼治疗后疾病持续存在的原因之一。同时，研究还发现 PIM 激酶是高激活 JAK2 的关键下游介质，联合使用 PIM 激酶抑制剂和 JAK 抑制剂可能是治疗 JAK 突变的 MPN 的有效策略。此外，研究中还发现了 ID1、MPL 和 TGM2 等基因在鲁索替尼处理后的变化，它们在 MPN 中的作用值得进一步研究。这项研究为 MPN 的治疗提供了新的理论依据和潜在的治疗靶点，有望推动 MPN 治疗领域的发展。
