创新优化多特异性 CAR-T 与 SARS-CoV-2 特异性 T 细胞，开启通用型过继细胞治疗新篇章

本文开发了多靶点低免疫原性嵌合抗原受体修饰 T 细胞（CAR-T）和病毒特异性 T 细胞（VST）用于通用型过继细胞治疗。通过基因编辑敲除 B2M 降低免疫原性，同时敲入 HLA-E 保护细胞免受自然杀伤细胞毒性，为相关疾病治疗带来新希望。

　　

引言

嵌合抗原受体修饰 T（CAR-T）细胞和病毒特异性 T（VST）细胞是常见的细胞疗法。CAR-T 已用于治疗 B 系急性淋巴细胞白血病、淋巴瘤和骨髓瘤等；VST 可用于治疗 Epstein-Barr 病毒（EBV）相关的移植后淋巴增殖性疾病，也在研究用于 SARS-CoV-2 感染的治疗 。然而，它们存在及时可用性、可负担性、质量可变性和体内持久性等方面的局限。为解决这些问题，研究开发了低免疫原性的 CAR-T 和 VST，通过多靶点设计和优化基因编辑技术，提升其治疗效果。

结果

1. 多特异性 CAR-T 和 VST 的生成：开展了双特异性 CAR-T（靶向 CD19 和 CD22）的临床试验，生产的临床产品具有高转导效率，对靶细胞有特异性细胞毒性。同时，制造了临床级 SARS-CoV-2 特异性 T 细胞，主要由 CD3⁺T 细胞组成，对 SARS-CoV-2 抗原具有特异性反应。
2. CRISPR-Cas9 核糖核蛋白（RNP）对 B2M 敲除的优化：设计了 5 种靶向 B2M 基因不同部位的向导 RNA（gRNA），其中 g5 靶向 B2M 第一外显子，敲除效率最佳。实验发现，经优化后，单 gRNA 分子（sgRNA）和 crRNA;tracrRNA 双链体编辑效果相当，后续实验选用 crRNA;tracrRNA 双链体以便于多位点敲除。
3. 双特异性 CAR-T 中 B2M 的持续敲除不影响 CAR 表达和增殖潜力：在双特异性 CAR-T 中，g5 同样展现出最佳编辑效率，平均约 80% 的细胞实现 B2M 敲除。B2M 敲除不改变 CAR⁺细胞比例，也不影响 CAR-T 的增殖潜力。
4. B2M 缺失的双特异性 CAR-T 免疫原性降低但保留抗白血病效力：单向混合淋巴细胞反应（MLR）试验表明，B2M 敲除的 CAR-T 免疫原性显著降低。同时，其对靶细胞的特异性细胞毒性与敲除前相似，证明编辑后的细胞在降低免疫原性的同时保留了抗白血病效力。
5. SARS-CoV-2 VST 中 B2M 的一致敲除不影响记忆细胞表型和增殖潜力：在 SARS-CoV-2 特异性 T 细胞中，约 80% 的细胞实现 B2M 敲除。敲除后细胞经磁珠分离得到高纯度敲除群体，且 B2M 敲除不改变记忆细胞表型组成，也不影响其增殖潜力。
6. B2M 敲除的 SARS-CoV-2 VST 免疫原性降低但保留抗 SMN 效力：MLR 试验显示，B2M 敲除的 SARS-CoV-2 VST 免疫原性显著降低。细胞对 SARS-CoV-2 SMN 肽的 IFN-γ 反应表明，编辑后的 VST 保留了识别 SARS-CoV-2 抗原的功能和特异性。
7. B2M 敲除的编辑特异性分析：通过靶向扩增子测序分析 B2M 敲除样本的编辑谱，发现 g5 的靶向编辑效率高，脱靶效应可忽略不计，仅两个敲除样本在一个脱靶位点有略微较高的插入缺失（indels）水平。
8. 通过位点特异性敲入在 B2M 位点表达 B2M-HLA-E 融合蛋白的策略：敲除 B2M 虽能降低 T 细胞免疫原性，但会使细胞易被 NK 细胞裂解。研究尝试通过同源直接修复（HDR）在 B2M 位点敲入 B2M-HLA-E 表达盒，利用 Cas9 切口酶（Cas9n）和腺相关病毒（AAV）递送的修复模板，提高敲入效率。
9. 配对 Cas9 切口酶实现高效敲入并消除脱靶编辑：筛选出与 g5 配对的 gRNA（s1、s2、s3），其中 g5-s2 配对在正常 T 细胞中敲除 B2M 的效率最高。使用 Cas9n 和 AAV 模板，在 B2M 位点实现了高效敲入，且通过 GUIDE-seq 分析和 T7E1 试验证明，该策略能消除潜在的脱靶编辑。
10. B2M-HLA-E 融合蛋白抵抗 NK 细胞诱导的细胞毒性：在 NK92MI 细胞模型和原代 NK 细胞实验中，B2M-HLA-E 敲入的 T 细胞能有效抵抗 NK 细胞的细胞毒性，保护细胞不被裂解，在双特异性 CAR-T 细胞中也有同样效果。

讨论

本研究展示了在临床级多特异性产品中高效敲除 B2M（>80%）的可行性，并通过新设计的 g5-s2;Cas9n-AAV6 系统将敲除过程转化为 B2M 位点特异性 “敲入”，重新表达 HLA-E，保护细胞免受 NK 细胞裂解。该制造和编辑过程可在单一临床仪器上完成，为生产即用型产品奠定基础，有望提高体内持久性、优化基因编辑效率和安全性，并降低成本。

多靶点策略对于应对抗原逃逸至关重要，如联合使用 CD19 和 CD22 CAR-T，以及针对 SARS-CoV-2 的多靶点 T 细胞治疗，可有效解决抗原逃逸问题。B2M 敲除和 HLA-E 敲入的联合策略能解决细胞疗法体内持久性不足的问题，且在临床级产品中通过一步电穿孔即可实现高比例 B2M 敲除，不影响细胞增殖潜力。

虽然 B2M 敲除会使细胞易被 NK 细胞裂解，但重新表达 B2M-HLA-E 融合蛋白可抑制 NK 细胞活性。同时，通过选择合适的供体（如 KIR - 配体 C1、C2 和 Bw4 阳性），可进一步增强编辑后 CAR-T 和 VST 的持久性。

CRISPR-Cas9 可能引发脱靶编辑，研究使用多种方法分析发现，g5 编辑特异性高，配对 Cas9n 方法能显著增强 Cas9 编辑的特异性，减少脱靶编辑。

T 细胞免疫在 SARS-CoV-2 清除和 COVID-19 康复中起关键作用，对于免疫功能低下患者，过继转移 SARS-CoV-2 VST 可引发快速而强大的免疫反应。本研究中，B2M 敲除使 SARS-CoV-2 特异性 T 细胞能够逃避同种异体排斥，促进异体过继转移，该平台还可用于生产针对其他病毒的 VST。

此外，同种异体 T 细胞治疗还面临移植物抗宿主病（GvHD）的限制。研究团队和其他研究者采用耗竭幼稚 T 细胞的策略，该策略不影响 VST 和 CAR-T 的功能，技术操作简便，且无需进一步基因组操作，可与 B2M 敲除后的 HLA-ABC^?细胞富集相结合，生产双向低免疫原性和低同种异体反应性的细胞产品。

本研究的优势在于使用真实患者的细胞产品，避免了细胞系和正常 T 细胞实验可能存在的偏差。同时，g5 crRNA;tracrRNA 和 g5-s2;Cas9n-AAV6 基因编辑方法新颖、通用且稳健。然而，研究也存在局限性，如 CAR-T 和 VST 虽低免疫原性，但仍可能被 CD4⁺细胞和巨噬细胞清除，未来可通过敲除 CIITA 和重新表达 CD47 来解决这一问题，且需要进一步研究确认这些细胞在体内的持久性和功能。

结论

研究提出了一个简单而强大的平台，可高效生成低免疫原性的双特异性抗 CD22/CD19 CAR-T 和三特异性抗 SMN SARS-CoV-2 T 细胞，这些细胞可用于通用型过继细胞治疗，有望更好地控制疾病、保障基因组安全、实现即时可用性、降低产品变异性和成本。