CRISPR-Cas9两步靶标捕获机制揭示高效基因组编辑的分子基础

这篇研究通过多学科方法揭示了CRISPR-Cas9系统高效基因组编辑的关键机制。研究团队发现PAM（protospacer-adjacent motif）松弛型Cas9变体（SpG/SpRY）因非特异性DNA结合和R-loop形成障碍导致编辑效率下降，提出"选择性弱PAM结合-快速DNA解旋"的两步优化模型。这项工作为设计更高效的RNA引导基因组编辑工具提供了理论基础，解决了PAM识别广度与编辑效率之间的根本矛盾。

　　

CRISPR-Cas9基因组编辑的效率之谜

Highlights
• Cas9通过两步识别靶序列：初始PAM结合和DNA解旋
• PAM松弛型Cas9（SpRY）在初始结合后形成动力学陷阱
• 动力学陷阱减缓靶标搜索和解旋速度，降低编辑效率
• 高效编辑需要特异性弱PAM结合与快速解旋的平衡

Summary
RNA引导的CRISPR-Cas9系统通过识别靶DNA序列 adjacent的短PAM序列启动基因组编辑。研究发现，降低PAM特异性会导致持续性非选择性DNA结合和guide RNA杂交失败，从而降低细胞内的基因组编辑效率。这项工作揭示了广泛PAM识别与编辑有效性之间的根本权衡，提出了优化的两步靶标捕获模型：选择性但低亲和力的PAM结合先于快速DNA解旋。

Reduced editing efficiencies arise from enzymatic limitations before R-loop completion
PAM松弛变体SpG（NG PAM）和SpRY（NR PAM）相比野生型SpyCas9（NGG PAM）表现出显著降低的基因组编辑效率。通过ddPCR检测发现，即使在质粒转染8小时后，SpG和SpRY的DNA切割效率仍比WT低2-4倍。RNP核转染实验显示，72小时后WT诱导约30%indels，而SpG和SpRY仅达4%和3%。这种效率差异源于酶内在特性，与表达水平无关。

Bulk生化实验揭示了DNA切割的两相动力学：快速主导相（k_fast）和慢速相（k_slow）。WT的k_fast在1分钟内完成靶链切割，而SpG和SpRY的k_fast慢约3.5倍。2AP荧光实验证实，这种延迟发生在R-loop完成之前，而非DNA切割化学步骤。

SpRY is inefficient at forming an initial stable R-loop intermediate
使用金转子珠追踪（AuRBT）技术，在单分子水平解析了靶标捕获过程。dSpRY与dCas9相比，形成R-loop中间体（I state，~8-10bp解旋）的速率k_C→I慢7倍，而中间体崩溃速率k_I→C快5倍。随后的R-loop传播（I?O）动力学则相似。这些结果表明SpRY在形成R-loop种子区域的第一步就存在障碍。

SpRY is kinetically trapped in a low-energy initial binding complex
动力学模型显示，dCas9表现出较弱的初始结合（K_d,init ~1-10μM）但能快速过渡到R-loop中间体（k_open >50 s^-1）。相比之下，dSpRY初始结合更强（K_d,init ~10nM）但过渡到中间体慢800倍（k_open ~0.06 s^-1）。引入错配气泡降低ΔG_Cbound→I能显著提高SpG和SpRY的切割速率，证实解旋能垒是关键限制因素。

Kinetic traps induce strong and promiscuous DNA binding
AuRBT实验显示，WT Cas9在非特异性位点产生短暂、小幅度的Δθ变化（~2bp解旋），而SpRY则表现出持续的基线偏移。拟合得出SpRY对非特异性位点的有效K_d,eff约14nM。高锰酸钾足迹实验证实，SpG和SpRY不诱导NGG位点附近的bp熔解，而是在多个位置引起非特异性胸腺嘧啶暴露。

Relaxed PAM specificity increases non-specific DNA interference
竞争实验表明，过量非特异性DNA显著抑制PAM松弛变体的活性。40倍质粒竞争物使WT的k_fast仅降低3.5倍，而使SpG和SpRY分别减慢40倍和200倍。使用鲑鱼精子DNA时，WT活性降低5倍，而SpG和SpRY则完全检测不到切割活性。EMSA证实SpRY对线性化质粒竞争