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在非洲爪蟾（Xenopus tropicalis）基因研究中，传统基因敲除和 RNA 干扰（RNAi）等方法存在局限。研究人员开展了关于 CRISPR - Cas13 和 CRISPRi（CRISPR interference）系统在非洲爪蟾胚胎中作用的研究，发现 CRISPRi 比 CRISPR - Cas13 更适合抑制特定 mRNA 转录，这为相关研究提供了新途径。
在生命科学的研究领域中，非洲爪蟾作为一种重要的两栖动物模型，凭借其独特的二倍体遗传背景和较短的世代时间，在遗传学、发育生物学以及再生生物学的研究中占据着关键地位。以往，利用基因组编辑技术，如 CRISPR/Cas9 系统，在非洲爪蟾中进行基因敲除的研究已较为成熟，能够通过对基因组的永久性改变来探究基因功能。然而，这种策略需要经过多代基因型筛选，才能建立起稳定的遗传品系，过程繁琐且耗时。
与此同时，RNA 干扰（RNAi）作为一种在众多生物中广泛应用的抑制靶基因表达的有效工具，在非洲爪蟾中却遭遇困境，无法发挥其应有的作用。此外，核酸类似物反义寡聚体 Morpholinos（MOs）虽然在非洲爪蟾研究中使用了二十多年，可通过阻断翻译或剪接来干扰基因功能，但近年来研究发现它会引发毒性和脱靶效应，使得其应用受到质疑。在这样的背景下，探寻一种高效、安全且适用于非洲爪蟾胚胎基因研究的方法迫在眉睫。
为了解决这些问题，暨南大学的研究人员开展了一项关于 CRISPR - Cas13 和 CRISPRi 系统在非洲爪蟾胚胎中作用的研究。研究结果表明，CRISPRi 而非 CRISPR - Cas13 是抑制非洲爪蟾胚胎中特定 mRNA 转录的有效且合适的方法，这一成果为非洲爪蟾胚胎基因功能的研究开辟了新的道路，论文发表在《Cell & Bioscience》。
研究人员主要运用了以下关键技术方法：首先是体外转录技术，用于合成相关的 mRNA 和 gRNA（guide RNA，引导 RNA） ；其次是胚胎显微注射技术，将合成的 mRNA、gRNA 以及相关质粒等注入非洲爪蟾胚胎中；最后利用定量实时荧光定量 PCR（qPCR）技术，检测基因的表达水平变化。
研究结果主要包括以下几个方面：
- Cas13 系统对非洲爪蟾胚胎中报告基因和内源基因表达的影响：通过将 Cas13 mRNA、gRNA 与报告基因 mRNA（如 EGFP）和参考基因 mRNA（如 mCherry）共注射到非洲爪蟾受精卵中，研究发现 PspCas13b 和 RfxCas13d 系统均无法显著降低报告基因 EGFP 的表达。进一步研究其对内源基因酪氨酸酶（tyr）表达的影响时，同样发现这两个系统不能有效抑制 tyr 基因的表达。即使增加 gRNA 的浓度，也无法改变这一结果。研究人员还发现，Cas13 系统在非洲爪蟾胚胎中可能无法正常表达，这或许是其不能发挥作用的原因之一。
- CRISPRi 对非洲爪蟾胚胎中报告基因和内源基因表达的影响：研究人员构建了报告质粒，并设计了针对报告基因的 gRNA，将 dCas9 - KM mRNA 和 gRNA 与报告质粒共注射到胚胎中。结果显示，dCas9 - KM 介导的 CRISPRi 系统能够显著抑制报告基因 mCherry 的表达。在研究其对内源基因的作用时，选择了 tyr、配对盒基因 6（pax6）、T - box 转录因子 T（tbxt）和肌球蛋白重链 6（myh6）等基因。研究发现，dCas9 - KM 系统可以有效抑制这些内源基因的表达，导致相应的表型变化，如 tyr 基因表达受抑制会使胚胎色素沉着减少，pax6 基因表达受抑制会影响眼睛发育，tbxt 基因表达受抑制会导致蝌蚪尾部发育异常，myh6 基因表达受抑制也出现相应变化。
- dCas9 - KM 系统的剂量效应及调节剂的影响：研究发现，300 pg 的 dCas9 - KM mRNA 足以有效抑制非洲爪蟾胚胎中 tyr 基因的表达，进一步增加剂量效果并不显著。对于 gRNA，200 pg 的 gTyr13 能显著增强 dCas9 - KM 系统抑制 tyr 基因表达的效果，更高剂量虽不会进一步增强抑制作用，但会增加严重白化表型的比例。此外，研究还发现 MS2 - MCP 平台能够增强 dCas9 - KM 系统的活性，新的 ZIM3 - KRAB（ZIM3K）结构域与传统的 dCas9 - KM 系统在抑制非洲爪蟾胚胎基因表达方面具有相当的能力。
研究结论和讨论部分指出，CRISPRi 系统是研究非洲爪蟾胚胎发育过程中特定基因功能的有效且直接的方法，基于 dCas9 - ZIM3K 和 dCas9 - KM 的 CRISPRi 系统在非洲爪蟾中具有相似的敲低能力，为高效抑制特定基因表达提供了合适的平台。这一研究成果不仅拓展了非洲爪蟾动物模型在器官发育和再生过程中特定基因功能研究的应用，也为相关领域的研究提供了重要的理论依据和技术支持，有助于推动生命科学和健康医学领域对胚胎发育机制及基因功能的深入理解。
