综述：生物材料的低温保存

本文聚焦生物材料低温保存技术，阐述其在医学、农业、保护等领域的广泛应用，如干细胞研究（Cryopreservation of stem cells）、生殖医学（Reproductive medicine）等。探讨相关经济影响，还指出研究方向。低温保存技术潜力巨大，值得关注。

　　

低温保存技术的核心原理与发展历程

低温保存（Cryopreservation）是现代科学的关键技术，能将细胞、组织和器官等生物材料在超低温下长期存储。其原理是通过降低温度，有效减缓或停止生物样本的生化和代谢过程，让它们处于 “暂停生命” 的状态。这一技术的核心是冷冻保护剂（Cryoprotective agents，CPAs），像二甲基亚砜（DMSO）和甘油等，它们能防止细胞内冰晶形成，避免细胞结构受损，确保生物材料在冷冻和解冻过程中的活性和功能。

低温保存的发展历程漫长而精彩。早期，人们虽有冷冻保存生物组织的想法，但因缺乏对生物学过程的理解，大多停留在理论阶段。1776 年，斯帕兰扎尼观察到精子在低温下仍能保持活力；19 世纪后期，研究人员开始尝试用低温保存精子和红细胞。真正的突破发生在 20 世纪 40 年代，甘油对红细胞的保护作用被发现，为现代低温保存技术奠定了基础。随后，控制速率冷冻技术、玻璃化技术等相继出现，不断推动着低温保存技术的发展。如今，低温保存已广泛应用于多个领域，成为不可或缺的重要技术。

冷冻保护剂的多样类型与作用机制

冷冻保护剂在低温保存中起着至关重要的作用，不同类型的冷冻保护剂有着不同的作用机制、应用场景和效果。

渗透型冷冻保护剂中，DMSO 应用最为广泛。它能穿透细胞膜，降低水的冰点，减少冰晶形成，稳定细胞结构。其常用浓度为 5 - 10%，可用于保存造血干细胞、动物细胞、精子、卵子和胚胎等多种细胞和组织。不过，高浓度的 DMSO 或解冻后未彻底清除，可能对细胞有毒性，使用时需格外小心。甘油也是常用的渗透型冷冻保护剂，能稳定细胞基质，减少冰晶形成。它在细菌、酵母细胞和哺乳动物细胞的保存中都有应用，且毒性相对较低，但解冻后去除甘油的过程较为复杂。乙烯 glycol 能降低溶液冰点，穿透细胞膜提供保护，常用于精子、胚胎等的保存，不过高浓度时也存在一定毒性。

非渗透型冷冻保护剂方面，海藻糖（Trehalose）通过稳定细胞膜和蛋白质来保护细胞，常与其他冷冻保护剂联合使用，可用于保存哺乳动物细胞、胚胎和植物细胞等，具有低毒、减少冰晶形成等优点，但成本较高，与其他冷冻保护剂混合使用时也存在一定挑战。羟乙基淀粉（Hydroxyethyl Starch，HES）则凭借其粘性降低冰晶形成，稳定细胞环境，用于多种细胞和干细胞的长期保存，不过它可能导致细胞聚集，且价格相对较高。

此外，还有一些特殊的冷冻保护剂，如从昆虫或鱼类中提取的天然抗冻蛋白（AFPs），毒性较低，但价格昂贵。在实际应用中，选择合适的冷冻保护剂需综合考虑细胞或组织类型、存储时间和低温保存过程的具体要求等因素。

丰富多样的低温保存技术与方法

低温保存的流程包含样本准备、控制冷冻、解冻和复苏等多个关键步骤。在准备阶段，需根据细胞或组织类型选择合适的冷冻保护剂并配置溶液；冷冻时，控制速率冷冻设备会以特定速率降低温度，避免冰晶形成，例如以 1°C/min 的速率降温至 - 80°C，随后将样本存储在 - 196°C 的液氮蒸汽相中；复苏时，快速解冻样本（如在 37°C 水浴中），减少冰晶再次形成的风险，解冻后还需清洗细胞，去除可能有毒的冷冻保护剂，再将细胞置于适宜的生长环境中恢复活力，通常采用台盼蓝排斥法或流式细胞术评估解冻后细胞的活力。

目前，低温保存技术丰富多样。慢速冷冻是逐渐降低生物材料的温度，通常速率为 1°C/min，该技术相对简单，设备要求不高，在许多细胞和组织的保存中应用广泛，但存在冷冻保护剂毒性和冰晶损伤细胞的风险，且过程较为耗时。玻璃化则是通过超快速冷却，使细胞内液体转变为玻璃态，避免冰晶形成，能提高胚胎和卵子等的解冻后存活率，但需要高浓度的冷冻保护剂，对操作技能要求高，并非所有细胞和组织都适用。中间温度冷冻是将样本冷却至 - 80 至 - 150°C，可减少冰晶形成，降低液氮存储成本，但该技术应用相对较少，效果也有待进一步验证。冷冻干燥（Freeze-drying，lyophilization）是在低温低压下去除水分，适用于保存蛋白质、疫苗等生物分子，在疫苗存储和运输方面具有重要意义。

此外，还有直接液氮冷冻、高压冷冻、超声冷冻、电冷冻、纳米管低温保存、超冷 / 冷藏、微流控低温保存、基于凝胶的低温保存、低温冷冻保存和自然低温保存等多种技术，每种技术都有其独特的优势和局限性，在不同的生物材料保存中发挥着作用。

不同生物材料的低温保存要点

不同生物材料的低温保存方法因材料特性而异。

动物细胞是常见的低温保存材料，细胞内冰晶形成会破坏细胞膜和细胞内结构。对于细胞系，慢速冷冻较为常用；而对于敏感细胞类型，玻璃化技术更为合适。DMSO、甘油和乙二醇等是常用的冷冻保护剂。不同类型的动物细胞对冷冻的敏感性不同，例如原代成纤维细胞对常规低温保存技术耐受性较好，而内皮细胞和上皮细胞则更容易受到损伤。

植物细胞由于具有坚硬的细胞壁，冷冻保护剂的渗透存在困难，增加了低温保存的复杂性。常用的冷冻保护剂包括 DMSO、甘油和山梨醇等，有时还需要特殊配方。玻璃化技术广泛应用于敏感植物组织，而慢速冷冻或包埋脱水法适用于特定的植物类型。包埋脱水法是将植物组织包裹在基质中，去除水分后再进行冷冻，处理过程中还需使用渗透剂（如 sorbitol）去除细胞内多余水分，防止冰晶损伤。

精子的低温保存相对简单，而卵子由于体积大、对冷冻敏感，保存难度较大。猪等物种的卵子细胞质中脂质含量高，进一步阻碍了冷冻过程。精子和卵子需要不同的冷冻保护剂和浓度，卵子对高浓度冷冻保护剂更为敏感。慢速冷冻常用于精子保存，而玻璃化技术则更适合卵子。此外，冷冻精子时通常需要去除精浆，以防止其对精子产生毒性。

血细胞（红细胞、白细胞和血小板）的低温保存用于临床输血。甘油、DMSO 和 HES 等可用于保护细胞完整性，防止溶血。红细胞和血小板对冷冻更为敏感，需要特定的保存方案，如红细胞通常采用慢速冷冻，血小板可能需要更专业的控制速率冷冻方法，白细胞（尤其是淋巴细胞）相对更具耐受性，但也需谨慎处理冷冻保护剂。

胚胎干细胞和成年干细胞的保存需要维持其多能性或分化能力以及活力。胚胎干细胞对冷冻更为敏感，常采用玻璃化技术保存；成年干细胞如间充质干细胞和造血干细胞则常用慢速冷冻或控制速率冷冻方法。DMSO、海藻糖和甘油等是常用的冷冻保护剂。

皮肤、肌肉等组织的低温保存需要保护细胞和细胞外基质的完整性。根据组织类型，可选择慢速冷冻或玻璃化技术。对于较大的组织，由于其结构复杂，冷冻难度较大。眼部组织（视网膜和角膜）的保存需要维持细胞完整性和功能，角膜内皮细胞对氧化应激和冷冻损伤敏感，视网膜冷冻保存通常需要更精确的控制，DMSO、甘油和海藻糖等常用于眼部组织的保存。

器官（如肾脏、心脏、肝脏）的低温保存要求更高，需要通过血管灌注冷冻保护剂，避免血管系统中冰晶的形成和损伤。由于器官体积大、结构复杂，冷冻保存面临诸多挑战，目前常用的方法是慢速冷冻结合冷冻保护剂灌注，主要目标是维持器官解冻后的功能和活力。

低温保存技术的广泛应用领域

低温保存技术在多个领域都有着重要应用。

在干细胞研究和治疗方面，低温保存对于造血干细胞的存储至关重要，用于骨髓移植治疗白血病和淋巴瘤等血液疾病。胚胎干细胞的低温保存支持再生医学研究，有望用于治疗多种疾病，如癌症、脊髓损伤和心血管疾病等。诱导多能干细胞的低温保存则有助于疾病建模和治疗研究。使用低温保存的干细胞进行移植，不仅能提高患者生存率，还能降低长期护理和住院成本，同时为干细胞库和治疗公司创造了经济机会。

生殖医学中，低温保存高质量的配子可提高辅助生殖技术（ART）的成功率，如体外受精（IVF），减少治疗周期和成本。它还能帮助个体在接受化疗等治疗前保存生育能力，促进生殖生物学、衰老和生育研究。随着社会趋势向晚育转变和癌症治疗生存率的提高，对生育保存服务的需求不断增加。

细胞治疗领域，低温保存是细胞治疗发展和应用的关键。在癌症免疫治疗中，T 细胞和其他免疫细胞的低温保存至关重要；在基因治疗中，经过基因修饰的细胞也需要低温保存，用于治疗遗传疾病；此外，低温保存还支持自身免疫性疾病的细胞治疗。

组织工程中，低温保存细胞 - 生物材料复合产品对组织再生至关重要。低温保存的皮肤细胞可用于烧伤患者和皮肤疾病患者的移植，用于软骨和骨组织再生的细胞也可低温保存，用于骨科应用。能够长期保存复杂的工程组织，将有望改变该行业的发展。

在制药、生物技术和生物医学研究中，微生物培养物和细胞系的低温保存对于生物制药生产至关重要，同时也有助于长期研究和实验的可重复性。生物有机体疗法是生物医学的一个有前途的方向，低温保存有助于实现灭活和活有机体疗法，如使用低温保存的粪便微生物群治疗胃肠道疾病，以及利用冷冻微针（cryoMNs）输送捕食性细菌治疗感染。

兽医学中，低温保存用于存储珍贵家畜的精液和胚胎，促进育种计划和遗传研究，有助于维持遗传多样性和提高育种效率，还可用于濒危物种的遗传保护，便于长期研究和实验的重复性。

组织和器官生物样本库中，低温保存可延长器官和组织的保存时间，缓解器官和组织短缺问题，减少移植等待时间，提高患者治疗效果，降低器官运输成本。许多因物流问题而被丢弃的捐赠器官，若能通过低温保存技术延长保存时间，将对移植医学、癌症手术治疗、创伤治疗等产生重大影响。

在美容和皮肤科应用中，低温保存的皮肤细胞可用于美容和皮肤科治疗，如皮肤 rejuvenation 和重建手术。

农业领域，低温保存有助于保存农作物和家畜的遗传物质，维持遗传多样性，促进抗逆作物品种和家畜品种的开发，提高农业生产力，稳定食品供应，降低作物歉收或家畜疾病带来的经济风险。例如，种子和植物种质的低温保存有助于开发具有优良性状的新作物品种，家畜精子的低温保存可提高肉类和奶制品的生产效率。

保护生物学中，低温保存濒危植物和动物物种的遗传物质，支持育种计划和保护工作，降低野生动物保护和栖息地恢复的成本，减轻生物多样性丧失对经济的影响，促进生态系统管理和生物多样性恢复，吸引资金和投资，推动环境和研究部门的经济增长。

低温保存技术的经济影响与潜力

低温保存技术在多个领域都产生了显著的经济影响。

在医疗保健领域，低温保存正在改变器官移植、干细胞治疗和生育保存的格局。器官移植规模在全球范围内不断扩大，但器官短缺问题依然严峻。低温保存器官和组织有助于解决这一问题，降低移植成本。例如，心脏移植手术成本高昂，且对时间要求苛刻，低温保存技术有望缓解这些挑战。干细胞治疗在再生医学中具有巨大潜力，使用低温保存的干细胞治疗疾病，可改善患者预后，减少长期护理和住院成本，推动干细胞治疗市场的快速增长，为干细胞库和治疗公司创造经济机会。生育诊所的低温保存和存储服务需求不断增加，为诊所带来了可观的收入，如美国卵子冷冻每个周期的费用可达 6000 - 15000 美元，年度存储费用也进一步增加了诊所收入。此外，低温保存支持生物样本库的发展，为药物研发和疾病研究提供稳定的生物样本供应，促进生物技术行业的经济发展。

农业方面，低温保存有助于保护农作物和家畜的遗传多样性，开发抗逆品种，稳定食品供应，降低农业生产风险，提高作物和家畜产量。通过保存遗传物质，可减少维持大规模育种群体的成本，为农业带来显著的经济效益。例如，利用低温保存的种质开发出的抗病小麦和玉米品种，为农业生产带来了重要的经济收益。

保护生物学中，低温保存濒危物种的遗传物质，有助于物种恢复和保护工作，降低野生动物保护和栖息地恢复的经济负担，减轻生物多样性丧失对经济的影响，吸引资金和投资，推动环境和研究部门的经济增长。

新兴产业中，低温保存支持生物工程组织和器官的开发和商业化，具有巨大的经济潜力。例如，生物工程皮肤用于烧伤治疗和低温保存组织用于器官移植的市场正在不断扩大。纳米技术在低温保存中的应用也为经济发展带来了新机遇，纳米颗粒可提高冷冻保护剂的效果，降低研究和临床应用成本，开拓新的市场。

低温保存技术的未来研究方向

尽管低温保存技术已取得显著进展，但仍面临诸多挑战，未来研究可从多个方向展开。

创新和优化冷冻保护剂是关键方向之一。传统冷冻保护剂在高浓度下可能有毒性，因此开发无毒或低毒的冷冻保护剂至关重要。研究还可聚焦于改进现有冷冻保护剂或其组合，减少冷冻和解冻过程中的细胞损伤，探索来自极端微生物的天然冷冻保护剂也具有很大潜力。

玻璃化技术的进一步发展也备受关注。目前，先进的玻璃化配方、增强玻璃化转变的技术、新型冷却和控制升温方法正在研究中，这些进展有望提高玻璃化技术的效果和应用范围。

纳米技术在低温保存中的应用前景广阔。纳米颗粒可改善冷却和加热过程的均匀性，更有效地输送冷冻保护剂，减少冰晶形成，降低细胞损伤。研究人员正在探索纳米技术在低温保存中的更多应用，以提高保存效果。

复杂组织和器官的低温保存是一个具有挑战性但意义重大的研究领域。目前，将低温保存技术扩展到血管化组织、整个器官和生物体仍面临困难。未来研究需关注改进灌注技术和冷冻保护剂输送系统，开发能够有效保存器官和血管化复合组织并确保其解冻后功能完全恢复的方案，这将为冷冻治疗带来重大突破，促进多种医疗干预的发展。

干细胞和生殖细胞的低温保存对于再生医学和生殖医学至关重要。研究如何提高干细胞解冻后的存活率和功能，优化冷冻保护剂溶液和解冻方案，开发个性化的低温保存方案，以及改进卵子和精子的保存方法，提高其保存、存活率和发育潜力，都是未来研究的重要方向。

开发最佳的解冻复温解决方案和改善冷冻后细胞修复过程也是重要的研究领域。这包括研究如何减轻冰晶损伤、氧化应激和其他冷冻保存过程中产生的损伤，提高细胞修复能力，解决器官和血管化复合组织保存的障碍。

从分子层面理解低温生物学，借助分子生物学和成像技术的进步，深入了解冷冻和解冻对细胞的分子影响，有助于开发更好的低温保存策略和新型冷冻保护剂。

此外，开发能够长期维持细胞完整性的存储解决方案，研究存储条件的影响，制定更稳定的低温保存方案；开发经济有效的方法，降低低温保存成本，提高其可扩展性，特别是对于发展中国家和小规模应用；探索低温保存与人工智能、基因组编辑等新兴技术的整合，增强其应用效果；以及关注低温保存技术在生殖医学和干细胞研究中的伦理和监管问题，制定合理的法规和伦理准则，确保技术的负责任使用和发展，都是未来低温保存技术研究的重要方向。