克鲁维酵母KmGcr1p与KmGcr2p糖酵解调控因子的共过表达策略：菊粉高温乙醇生产的效率突破

为解决非粮生物质乙醇生产中糖酵解效率低、高温耐受性不足等问题，研究人员通过共过表达克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）糖酵解调控因子KmGCR1和KmGCR2，构建工程菌株Ogcr1+2，使菊粉酶活性提升55.8%，42℃下菊粉和菊芋粉乙醇产量分别提高36.0%和39.5%。该研究为高温CBP（整合生物加工）乙醇生产提供了兼具高效糖化、耐热性和乙醇耐受性的创新策略。

　　

论文解读

随着能源安全与环境可持续性问题的加剧，生物乙醇作为化石燃料的绿色替代品备受关注。然而，传统以粮食淀粉为原料的生产模式引发粮食安全争议，而木质纤维素原料的复杂预处理工艺又制约其经济性。菊粉（inulin）——一种主要存在于菊芋块茎中的可溶性多糖，因其可通过单一外切菊粉酶（exo-inulinase）高效水解为果糖和葡萄糖，成为理想非粮底物。但现有菊粉乙醇生产仍面临高温环境下发酵效率低、菌株耐受性不足等瓶颈。

针对这一挑战，中国的研究团队以耐高温的克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）KM-0为研究对象，聚焦糖酵解调控网络。前期研究发现，该菌的糖酵解调控因子KmGcr1p不仅能激活糖酵解基因，还可通过结合CT-box特异性上调菊粉酶基因表达。然而，其协同调控机制尚不明确，尤其是另一调控因子KmGcr2p的功能未被揭示。为此，研究人员通过基因共过表达策略，系统解析了KmGcr1p与KmGcr2p的互作机制，并开发出兼具高效糖化与发酵性能的工程菌株。

关键技术方法
研究采用基因克隆与序列分析鉴定KmGCR2特性；通过酵母双杂交（Y2H）和免疫共沉淀（Co-IP）验证蛋白互作；构建过表达菌株Ogcr1+2，测定菊粉酶活性（U/mL）、生长曲线及乙醇产量；利用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析靶基因表达；以菊粉和菊芋粉为底物进行高温（42℃）发酵评估。

研究结果

KmGcr2p的特性解析
KmGcr2p缺乏DNA结合域，但通过物理互作增强KmGcr1p对菊粉酶基因（KmINU1）、糖酵解基因（如KmHXK1、KmPFK1）及乙醇合成基因（KmADH1）的转录激活能力。这种协同作用使Ogcr1+2菌株的菊粉酶活性达194.7 U/mL，较野生型提升55.8%。

耐受性与发酵性能提升
共过表达使菌株在37-45℃下的生长量提高18.3%-24.6%，10%乙醇胁迫下的存活率提升127.1%。高温（42℃）发酵中，菊粉和菊芋粉的乙醇产量分别达到36.0 g/L和34.8 g/L，增幅达36.0%和39.5%。

结论与意义
该研究首次阐明KmGcr2p通过协同KmGcr1p增强糖酵解通路的分子机制，并创新性地提出“糖酵解调控因子共调控”策略，实现菊粉水解、耐热性、乙醇耐受性与发酵效率的同步优化。成果发表于《Bioresource Technology》，为菊粉基高温CBP乙醇的工业化提供了理论依据与菌种资源，尤其适用于菊芋等耐逆作物的综合利用，推动非粮生物燃料的可持续发展。