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这篇研究聚焦巴基斯坦信德省，检测饮用水、废水及生物膜中的伤寒沙门氏菌（S. Typhi）和 blaCTX-M基因。发现S. Typhi和 blaCTX-M基因存在于多种样本中，生物膜或为传播源头。研究为防控伤寒及水传播疾病提供关键依据。
引言
伤寒热是一种严重的发热性疾病，在低收入和中等收入国家更为常见。其病原体伤寒沙门氏菌（Salmonella enterica serotype Typhi，S. Typhi），人类是其唯一已知的动物宿主。全球每年估计有 1100 - 2100 万例伤寒热病例，导致 20 万人死亡。伤寒主要通过食用被S. Typhi污染的食物和水传播，因此在缺乏清洁水和适当卫生设施的地区传播更为严重。巴基斯坦约 20% 的人口可获得清洁饮用水，该国约 30% 的疾病和 40% 的死亡归因于水质差，所以极易爆发伤寒热。
抗生素的出现降低了伤寒热的发病率，但滥用导致全球出现耐多药（MDR）的S. Typhi菌株。近期，巴基斯坦信德省出现了广泛耐药（XDR）的S. Typhi。2016 年 11 月至 2021 年 8 月，信德省的卡拉奇、海得拉巴等地报告了 21203 例 XDR 伤寒热病例，目前该省约 70% 的伤寒热病例为 XDR。这种 XDR 菌株被认为是S. Typhi获得携带 blaCTX-M-15基因的质粒后克隆扩增产生的。研究表明，巴基斯坦人群中携带 blaCTX-M-15很常见，环境中的流行率也很高。
传统基于培养的方法难以检测环境样本中的S. Typhi，PCR 检测成为首选方法。环境源类型会影响S. Typhi的检测，生物膜是微生物间抗菌耐药基因转移的理想场所，若饮用水生物膜含有病原体和耐药基因，将带来严重问题。本研究旨在确定信德省城市地区饮用水、废水及其相关生物膜中是否存在S. Typhi，并确定 blaCTX-M-15基因的环境流行率。
方法
研究在巴基斯坦人口第二多的信德省进行，该省位于该国最南部，属亚热带地区，人口约 4780 万。研究于 2020 年 11 月和 2021 年 7 月在海得拉巴和卡拉奇收集样本，使用 ArcMap 10.8 软件绘制采样点地图。
共收集 70 份样本，包括 35 份废水和 35 份饮用水。饮用水样本来自市政管道供水的地下蓄水池（30 份）或选定地点的地下水户外水龙头（5 份），废水样本收集在无菌 50 - 100 mL 锥形管中。同时，用无菌 ESwab 常规拭子擦拭 4×4 英寸的水管或蓄水池壁表面，收集 70 份相关生物膜样本。
样本采集后用冰袋冷藏运输至美国 - 巴基斯坦高级水研究中心（USPCAS - W）进行检测。废水样本先通过 5μm 注射器过滤器预过滤去除杂质，饮用水和处理后的废水样本再通过 0.45μm 无菌一次性过滤杯过滤。过滤后的样本和生物膜拭子分别处理后，取 10μL 10 倍稀释液（10-1至 10-5）接种到异养平板计数（HPC）琼脂上，测定每样本的活菌数。
使用 PowerSoil DNA 分离试剂盒提取样本 DNA，在 USPCAS - W 通过常规 PCR 检测 blaCTX-M-15基因，通过定量 PCR（qPCR）检测S. Typhi基因，之后将处理后的样本送至美国耶鲁大学公共卫生学院进行确认性 PCR 检测。使用 CTX - M 组 1 引物作为检测 blaCTX-M-15变体的替代方法，以临床S. Typhi菌株提取的 DNA 和 gBlocks 基因片段作为阳性对照，进行单重常规 PCR 反应，产物在 1% 琼脂糖凝胶上电泳。
结果
在 140 份样本中，有两份检测到S. Typhi DNA，分别是一份废水样本和一份饮用水生物膜样本。blaCTX-M组 1 基因（代表 blaCTX-M-15）在两份饮用水样本和一份饮用水生物膜样本中被鉴定出来，且该生物膜样本与阳性饮用水样本并非来自同一地点。在废水中，13 份水样和 21 份生物膜样本检测到 blaCTX-M组 1 基因，其中 9 份（69.2%）废水样本对应的生物膜样本也呈阳性，但总体样本对的一致性为 54.3%，表明废水和同一采样点生物膜中 blaCTX-M组 1 基因的存在无显著关联。携带S. Typhi的废水样本对应的生物膜样本中检测到 blaCTX-M组 1 基因，但S. Typhi阳性样本中未检测到该基因。
HPC 结果显示，废水的总 HPCs 高于饮用水，废水生物膜的 HPCs 高于饮用水生物膜。虽然生物膜和水样的 HPCs 计数相似，但由于测量单位不同（水样按体积，生物膜按表面积），两者比较无意义。且检测到 blaCTX-M基因的样本和未检测到的样本，HPCs 无显著差异。
讨论
环境中耐药性不断增强的S. Typhi在社区水系统中的传播是严重的公共卫生问题。本研究首次调查饮用水和废水生物膜中S. Typhi的存在情况，并首次在饮用水生物膜中鉴定出S. Typhi，还首次证实巴基斯坦环境生物膜中 blaCTX-M组 1 基因的广泛传播。但由于S. Typhi检测频率低，无法确定其与采样时间或环境源的统计关联。
在生物膜，尤其是饮用水生物膜中检测到S. Typhi和 blaCTX-M基因，对公共卫生和环境监测意义重大。当前环境监测策略通常只对水样采样，可能会遗漏生物膜这一重要的病原体和耐药基因储存库。S. Typhi可在环境生物膜中存活、附着、生长，生物膜的间歇性释放会使病原体进入水体，增加传播风险。
海得拉巴和卡拉奇作为信德省的重要城市，在提供清洁饮用水和卫生设施方面面临挑战。快速城市化、设施投资不足、气候因素（高温、降雨不稳定）以及卫生设施不完善，都促进了S. Typhi的传播，饮用水的粪便污染和生物膜形成也加剧了这一问题。
除S. Typhi检测外，本研究还检测了 blaCTX-M-15基因（以 blaCTX-M组 1 基因作为替代）的分布和流行率。产超广谱 β - 内酰胺酶（ESBL）的肠杆菌科细菌在亚洲多国水环境中被发现，对公共卫生构成威胁，因其对第三代头孢菌素和单环 β - 内酰胺类抗生素耐药。本研究中超过四分之一的环境样本检测到 blaCTX-M组 1 基因，且在废水和生物膜中的检出频率显著高于饮用水。虽然未确定携带 blaCTX-M基因的细菌种类，但研究结果支持了之前关于产 ESBL 肠杆菌的报道。
本研究存在局限性，采样时间有限，S. Typhi阳性样本少，无法确定其季节性和与人类病例的平行趋势。PCR 引物针对的是 blaCTX-M组 1 基因，而非 blaCTX-M-15特异性引物；PCR 检测无法确定S. Typhi的活力和 blaCTX-M基因的宿主；生物膜和水样的测量单位不同，限制了两者比较；生物膜采样无法确定病原体或耐药基因首次进入系统的时间。这些问题表明，需要进一步研究以更好地理解生物膜采样的意义和作用。
