胆固醇 25 - 羟化酶（CH25H）：抗新城疫病毒（NDV）的多面 “卫士”，开辟抗病毒疗法新路径

本文聚焦胆固醇 25 - 羟化酶（CH25H）对新城疫病毒（NDV）的作用机制。研究发现，CH25H 可经酶活性依赖（通过 25 - 羟胆固醇，25HC）和非依赖机制抑制 NDV 复制，还能与病毒核蛋白（NP）互作。这为抗 NDV 及相关病原体药物研发提供了新靶点。

　　

引言

新城疫病毒（NDV）隶属副黏病毒科正禽腮腺炎病毒属，对全球家禽业危害巨大，其基因组为线性、非节段、负义单链 RNA，编码多种蛋白，其中核蛋白（NP）在病毒复制中至关重要。细胞脂质参与 NDV 复制过程，胆固醇 25 - 羟化酶（CH25H）作为内质网相关酶，催化胆固醇生成 25 - 羟胆固醇（25HC），参与胆固醇和脂质代谢，是一种干扰素刺激基因（ISG）。已有研究表明，CH25H 及其产物 25HC 具有广谱抗病毒活性，但它们对 NDV 的作用机制尚不明确。

结果

1. CH25H 基因表达与对 NDV 复制的抑制作用：用 NDV NA-1 株感染 DF-1 细胞，qRT-PCR 检测发现，感染 12 小时后 CH25H mRNA 显著上调，24 小时达到峰值，36 小时下降；而 NDV NP mRNA 水平随时间显著增加。将 CH25H 表达质粒转染 DF-1 细胞后感染 NDV，与对照组相比，NP mRNA 水平在 24 小时显著降低，NP 蛋白水平和病毒滴度在 12、24 和 48 小时均显著降低，表明过表达 CH25H 可显著抑制 NDV 复制。
2. CH25H 基因敲低促进 NDV 复制：设计 3 种针对 CH25H 基因的小干扰 RNA（siRNAs）转染 DF-1 细胞，qRT-PCR 显示 siRNA1 敲低效率最高。用 siRNA1 转染 DF-1 细胞后感染 NDV，NP mRNA 水平和蛋白表达增加，病毒滴度显著上升，说明敲低 CH25H 可增强 NDV 复制。
3. 重组 NDV 表达 CH25H 的构建与特性分析：基于反向遗传学构建重组 NDV（rNDV-CH25H），将编码 CH25H 的人工转录盒插入 NDV NA-1 株基因组 P 和 M 基因之间，经 RT-PCR 和测序验证插入成功。免疫荧光染色显示，rNDV-CH25H 感染的 DF-1 细胞可检测到 CH25H 蛋白和 NP，而 NDV 感染细胞仅检测到 NP。生长动力学分析表明，rNDV-CH25H 在 DF-1 细胞和鸡胚中的复制显著降低，致病性减弱。
4. 25HC 抑制 NDV 复制：用不同浓度 25HC 处理 DF-1 细胞，CCK-8 检测显示浓度低于 1 μM 时无细胞毒性。用 1 μM 25HC 预处理 DF-1 细胞后感染 NDV，qRT-PCR、western blot 和 TCID₅₀检测发现，25HC 显著降低病毒 NP mRNA 水平、NP 蛋白水平和病毒滴度，表明 25HC 能有效抑制 NDV 在 DF-1 细胞中的复制。
5. 25HC 抑制 NDV 感染的机制：通过检测不同阶段病毒 NP mRNA 水平，发现 25HC 处理在 NDV 附着、复制和释放阶段与对照组无显著差异，但在穿透阶段，NP mRNA 水平、NP 蛋白表达和病毒滴度显著降低，表明 25HC 通过阻断病毒穿透抑制 NDV 感染。
6. 缺乏羟化酶活性的 CH25H 突变体仍抑制 NDV 复制：构建 CH25H 催化突变体（CH25H-M），将其表达质粒转染 DF-1 细胞后感染 NDV。qRT-PCR、western blot 和 TCID₅₀检测显示，CH25H-M 和野生型 CH25H 均显著下调 NP mRNA 和蛋白水平，降低病毒滴度，说明 CH25H-M 虽缺乏羟化酶活性，但仍保留抑制 NDV 复制的能力。
7. CH25H 与 NP 相互作用并下调其表达：共转染 Flag-tagged CH25H 和 HA-tagged NP 表达质粒至 DF-1 细胞，免疫荧光染色显示二者在细胞质共定位，免疫共沉淀验证了它们的相互作用。western blot 表明 CH25H 蛋白可剂量依赖性下调 NP 表达。用蛋白酶体抑制剂 MG132、自噬抑制剂 3 - 甲基腺嘌呤（3-MA）和细胞凋亡抑制剂 Ac-DEVD-CHO 处理细胞，均不影响 CH25H 介导的 NP 降解，提示存在其他降解机制。利用小基因组系统发现，CH25H 可抑制由 NP、P 和 L 蛋白组成的病毒核糖核蛋白（RNP）复合物活性，表明 CH25H 通过与 NP 相互作用干扰病毒 RNP 活性发挥抗病毒作用。

讨论

鸡 CH25H 是鸡干扰素 -α（IFN-α）诱导的 ISG 之一，本研究发现其在 NDV 感染时表达上调，通过酶活性依赖和非依赖机制影响 NDV 复制。25HC 通过干扰病毒内化抑制 NDV 感染，这与胆固醇在副黏病毒进入细胞过程中的关键作用相关，凸显了 25HC 作为广谱抗病毒剂的潜力。构建的重组 rNDV-CH25H 在细胞和鸡胚中生长受限，证实 CH25H 有效限制 NDV 复制。CH25H-M 保留抗 NDV 活性，揭示其存在非酶促抗病毒机制，即与病毒 NP 结合并下调其表达，且该过程不依赖经典蛋白降解途径。NP 是 NDV 复制关键蛋白，CH25H 与 NP 相互作用抑制 RNP 活性，减少病毒转录和复制，这为研究宿主因子限制负链 RNA 病毒复制提供了新视角。未来研究可聚焦于 CH25H 与 NDV NP 相互作用的特征及其对 RNP 组装和病毒复制的影响。综上，本研究揭示了 CH25H 抗 NDV 的多方面机制，为开发抗 NDV 及相关病原体的新策略提供了有前景的靶点。

材料和方法

1. 细胞、病毒和抗体：研究使用中国分离的 NDV NA-1 株（GenBank: DQ659677），为速发型基因型 VII 病毒；重组 NDV 表达增强型绿色荧光蛋白（rNDV-EGFP）；DF-1 细胞在含 10% 胎牛血清的杜氏改良 Eagle 培养基（DMEM）中培养。使用自制的小鼠抗鸡 CH25H 多克隆抗体和兔抗 NDV NP 多克隆抗体。
2. 质粒构建和转染：PCR 扩增 CH25H 编码序列，克隆至 pCAGGS 载体构建 pCAGGS-Flag-CH25H；定点突变构建 CH25H-M 质粒。采用 X-tremeGENE HP DNA 转染试剂按 4:1 比例将质粒 DNA 转染至 DF-1 细胞。
3. siRNA 实验：设计合成 3 对针对鸡 ch25h 基因的 siRNAs，用 GP-transfect-Mate 转染试剂将其或非特异性阴性对照（NC）转染至 DF-1 细胞，48 小时后用 qRT-PCR 检测 CH25H 水平。
4. qRT-PCR：用 RNA 提取试剂盒提取 DF-1 细胞总 RNA，逆转录为 cDNA 后进行 qRT-PCR，以 GAPDH 为内参，采用 ΔΔCt 法分析数据。
5. western blot 分析：用 RIPA 裂解缓冲液裂解细胞，离心收集上清，经 SDS-PAGE 分离蛋白并转至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，用相应抗体进行免疫印迹检测。
6. 免疫共沉淀（IP）：质粒转染后收集细胞，用 Western 和 IP 裂解缓冲液裂解，细胞裂解液上清与 Flag 单克隆抗体 4°C 孵育过夜，再与蛋白 A + G 琼脂糖 4°C 孵育 3 小时，经 SDS-PAGE 和 Western blot 分析。
7. 病毒滴定：采用 TCID₅₀实验评估病毒滴度和感染性，将 Vero 细胞接种于 96 孔板，接种系列稀释病毒，培养 3 - 5 天，用 Reed - Muench 法计算 TCID₅₀值。
8. 免疫荧光染色：用 4% 多聚甲醛固定 DF-1 细胞，0.1% Triton X-100 透化，依次与 Flag 单克隆抗体、荧光素异硫氰酸酯标记的山羊抗兔 IgG（H + L）抗体孵育，用 4′,6 - 二脒基 - 2 - 苯基吲哚（DAPI）染色，用倒置荧光显微镜观察。
9. 细胞活力检测：将 DF-1 细胞接种于 96 孔板，用不同浓度 25HC 处理 24 小时，加入 CCK-8 试剂，1 小时后测量 450 nm 吸光度。
10. 重组病毒拯救：PCR 扩增 CH25H 开放阅读框（ORF）及相关序列，插入 pCI-NA-1 构建 pCI-NA-CH25H。293T 细胞共转染 pCI-NA-CH25H 与 NP、P、L 辅助质粒，收获上清接种鸡胚，经血凝（HA）试验筛选，获得重组病毒 rNDV-CH25H。
11. 小基因组报告实验：构建小基因组报告质粒 NDV-MG，转染 BSR 细胞并共转染 NP、P、L 辅助质粒和 CH25H 表达质粒或对照载体，48 小时后用荧光显微镜观察并量化 EGFP 阳性细胞。
12. 统计分析：数据以平均值 ± 标准差（SD）表示，用 GraphPad Prism 9.0 软件进行单因素方差分析（ANOVA），P < 0.05 为差异有统计学意义。

致谢

本研究受吉林省科技发展计划（20220101314JC、YDZJ202102CXJD029、YDZJ202301ZYTS326）和国家自然科学基金（U21A20261、32473121）资助。作者声明无潜在利益冲突。