青蒿素抗性恶性疟原虫的配子体产生与传播适应性研究：非洲与亚洲分离株的差异揭示疟疾防控关键线索

本文研究了非洲和亚洲不同 K13 基因型的恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）分离株的配子体产生和传播适应性。通过对青蒿素敏感（ART-S）和抗性（ART-R）分离株的实验，发现 ART-R 寄生虫在不同按蚊中仍具传播性，但未显示直接传播优势，为疟疾防控策略提供参考。

　　

研究背景

尽管全球致力于降低疟疾负担，但进展在过去十年停滞，部分地区疟疾疫情回升。恶性疟原虫对青蒿素产生部分抗性（ART-R），其特征为寄生虫清除时间延长（半衰期 > 5 小时）或在青蒿素单药治疗或青蒿素联合疗法（ACT）后第 3 天仍存在寄生虫血症 。ART-R 主要与 PfKelch13（K13）蛋白 β- 螺旋桨结构域的特定突变相关，这些突变降低 K13 蛋白水平，干扰血红蛋白进入寄生虫消化液泡，影响青蒿素激活。K13 突变对寄生虫抗性和适应性的影响因突变类型和寄生虫背景而异。临床上相关的 K13 突变最早在 2002 年柬埔寨西部的分离株中发现，随后在大湄公河次区域传播。近期在东非和非洲之角也出现了与 ART-R 相关的 K13 突变，这引发了对其适应性、抗性和传播潜力的疑问。了解不同按蚊的媒介能力以及 K13 突变寄生虫是否具有传播优势，对预测 ART-R 在非洲大陆的传播至关重要。

材料与方法

1. 寄生虫培养：培养包括 ART-S 的 NF54（非洲）、NF135（柬埔寨）、NF180（乌干达）和 ART-R 的 ARN1G（泰国）、3815（柬埔寨）、PAT-023（乌干达）等寄生虫株。使用添加 10% 人血清的 RPMI 培养基在自动化培养系统中培养，配子体培养用于蚊饲时，设定统一的 1% 寄生虫血症，培养 14 天成熟。无性繁殖寄生虫培养通过磁分离或山梨醇裂解维持同步状态，不超过 25 个周期。使用最小脂肪酸培养基或 0.5% Albumax 诱导配子体，在添加 10% 人血清的 RPMI 培养基中成熟。提取寄生虫 DNA，进行测序和分析。
2. 环期生存试验（RSA）：采用改良的 RSA 方法，通过双磁珠纯化获得高度同步的寄生虫。将同步化的裂殖体培养 3 - 4 小时，使其破裂并侵入新的红细胞，再次通过磁柱分离获得新侵入的环状期寄生虫。将寄生虫分为两组，一组用于性转化试验，一组用于 RSA。在 RSA 中，将寄生虫稀释至 1% - 2% 的寄生虫血症，在 2% 的血细胞比容下培养，每个株系在四个孔中测试，两个为 DMSO 对照，两个为二氢青蒿素（DHA）处理。处理后通过吉姆萨染色涂片和流式细胞术测定生存率。
3. 性转化试验：对双同步化后的寄生虫培养 24 小时后进行性转化试验。将每个寄生虫分离株在三种不同培养基中以 1% 寄生虫血症、5% 血细胞比容培养在孔板中，通过吉姆萨染色涂片计算转化速率。
4. 蚊虫感染：饲养实验室品系的斯氏按蚊（Anopheles stephensi，Nijmegen Sind-Kasur 株）、冈比亚按蚊（An. gambiae s.s，Kisumu 株）和科卢兹按蚊（An. coluzzii，N’gousso 株），在 26°C、70% - 80% 湿度和 12 小时昼夜颠倒的条件下培养。在配子体培养物中观察到出丝现象且配子体血症达到至少 0.1% 时进行蚊饲。使用玻璃膜微型饲养器，让 1 - 5 天龄的 100 只雌性按蚊吸食含有配子体的血液 15 分钟，选择饱血的蚊子，在 30°C 下提供 5% - 10% 葡萄糖饲养。
5. 动合子计数：感染后 18 - 24 小时检查蚊子中肠，用抗 25KD - FITC 结合物和伊文思蓝溶液处理。解剖五只中肠，释放血餐，孵育、洗涤、离心后，将沉淀重悬，取 5μL 悬液在 Bürker - Turk 计数室中，在荧光显微镜下计数圆形体、曲颈形体和成熟动合子。
6. 卵囊计数：感染后第 7 天，解剖每组 20 只蚊子的中肠，用 1% 汞溴红染色，在光学显微镜 100 倍放大下检测和量化卵囊。
7. 子孢子计数：感染后第 4 - 6 天，给用于检查子孢子发育的蚊子提供第二次（未感染）血餐，使卵囊发育同步。感染后第 15 天，解剖蚊子唾液腺，提取 DNA，使用 COX - I qPCR 分析子孢子密度。
8. 统计分析：使用 R 软件进行统计分析。用混合效应负二项回归模型估计卵囊、子孢子和动合子的平均计数（95% 置信区间），用混合效应 β 回归模型计算平均生存率和转化率（95% 置信区间），用贝叶斯泊松回归模型评估 DHA 的传播减少活性（TRA）和传播阻断活性（TBA）。

研究结果

1. 寄生虫背景：研究使用了来自非洲、东南亚和东非的恶性疟原虫参考株系，以及之前发表的 ART-R K13 突变寄生虫株系和新收集的乌干达 ART-R 分离株 PAT-023。基因分型显示部分分离株携带对氯喹和磺胺多辛 - 乙胺嘧啶耐药的突变。
2. 青蒿素抗性：ART-R 株系 ARN1G 和 3815 在 RSA 中的生存率高于 ART-S 的 NF54。ART-S 的 NF135 生存率变化较大，低于已知 ART-R 株系但高于 NF54 和 NF180。PAT-023 的生存率为 9.1%（95% CI：6.6% - 12.5%），高于 ART-S 株系。
3. 性转化：在不同培养基中，最小脂肪酸培养基诱导的配子体转化率最高。K13 突变株系的转化率与 ART-S 株系相当，除了柬埔寨的 3815 株系转化率变化较大。乌干达的 ART-R 株系 PAT-023 性转化率极低，不同培养基间差异小。
4. 向蚊子的传播：在不同按蚊中，ART-S 的 NF180 和 NF135 成熟动合子数量无明显差异，NF54 在冈比亚按蚊中的成熟动合子数量倾向于少于斯氏按蚊和科卢兹按蚊。ART-R 的 ARN1G 趋势类似，PAT-023 在斯氏按蚊中的成熟动合子显著少于科卢兹按蚊，3815 在所有按蚊中成熟动合子数量均低。非洲寄生虫株系在非洲按蚊中的卵囊密度较高，如 PAT-023 在非洲按蚊中的卵囊密度显著高于斯氏按蚊。亚洲 K13 突变株系在斯氏按蚊中的卵囊密度略高于非洲按蚊。3815 感染水平低且变化大。ARN1G 和 3815 在至少一种非洲按蚊中的子孢子产量有增加趋势，但 3815 的传播结果仍高度可变。
5. DHA 的传播阻断作用：使用科卢兹按蚊测试两种 DHA 浓度对寄生虫传播的影响。所有分离株随着 DHA 浓度增加，蚊子感染强度和流行率均下降，与 K13 基因型和寄生虫背景无关。在 7000nM DHA 浓度下，非洲分离株偶尔感染蚊子，亚洲分离株未感染。7000nM DHA 使所有寄生虫分离株的卵囊强度降低超过 93%，ART-R 分离株未显示出对 DHA 传播阻断效果的降低。
6. 抗性与传播阶段的相关性：未观察到 RSA 中寄生虫生存率与 DHA 压力下卵囊密度降低之间的相关性。相反，观察到 RSA 中寄生虫生存率与诱导后的配子体转化率呈弱负相关。

讨论

了解青蒿素治疗后存活寄生虫的传播适应性对制定防控策略很重要。有研究表明 K13 突变寄生虫可能具有更高的内在配子体产生能力，但也有体内证据显示 K13 突变与配子体产生减少有关，体外研究则发现 K13 突变体的雄性配子体在 DHA 暴露下存活率增加。本研究选择了具有不同 K13 基因型和遗传背景的寄生虫分离株，亚洲 ART-R 株系 ARN1G 和 3815 在 RSA 中寄生虫存活率较高，新发现的乌干达 ART-R 株系 PAT-023（K13 野生型）在体外 RSA 中也显示出高存活率，NF135 的 DHA 存活率不稳定且偶尔升高。研究聚焦于恶性疟原虫分离株的传播潜力，最小脂肪酸培养基在所有株系中诱导的性转化率最高。ART-R 分离株在未治疗时未显示出性转化率增加，且未探讨 DHA 对这些株系性转化率的影响。性转化率高并不总是与蚊子感染率高相关，3815 株系传播潜力低，非洲寄生虫在非洲按蚊中表现更好，可能与影响寄生虫逃避蚊子免疫系统的基因有关。未观察到卵囊大小明显增加，但部分亚洲 ART-R 株系子孢子产量较高。DHA 对成熟配子体的传播阻断效果不受 ART-R 影响，但未研究 DHA 对未成熟配子体的影响。本研究样本数量有限，未来需使用基因工程株系在同基因背景下进一步研究 K13 突变对配子体产生、感染性和对青蒿素抗性的影响。