双等位基因 UGGT1 变异引发先天性糖基化障碍：揭开罕见疾病的神秘面纱

本文发现双等位基因 UGGT1 变异可致先天性糖基化障碍（CDG）。研究通过对多家族临床、遗传及分子研究，揭示其临床特征、基因型 - 表型关联等，拓宽了 N - 连接糖基化障碍疾病谱，对理解相关疾病机制和诊断意义重大。

　　

引言

糖基化是生物体内重要的分子过程，糖结合物（glycoconjugates）由碳水化合物链（聚糖，glycans）与蛋白质或脂质共价连接而成。先天性糖基化障碍（Congenital disorders of glycosylation，CDGs）是一组临床和遗传异质性疾病，主要由糖结合物合成和加工缺陷引起，常表现为多系统受累，如神经发育迟缓、生长不良、肝病和凝血障碍等。

大多数常见的 CDGs 是由 N - 连接糖基化错误导致，涉及该生物途径不同阶段的分子缺陷。UDP - 葡萄糖：糖蛋白葡糖基转移酶 1（UDP - glucose:glycoprotein glucosyltransferase 1，UGGT1）是通过 N - 糖蛋白质量控制途径实现正确糖蛋白折叠的关键分子，它能识别并重新葡糖基化错误折叠的蛋白质，使其保留在内质网（endoplasmic reticulum，ER）中，重新结合钙网蛋白（calnexin，CNX）/ 钙连蛋白（calreticulin，CRT）以实现正确折叠。UGGT1 功能异常会导致错误折叠的蛋白质在内质网腔中积累，引发内质网应激，激活下游信号网络，若无法恢复内质网稳态，可能触发细胞凋亡途径。UGGT1 有一个同源物 UGGT2，但 UGGT1 被认为是负责错误折叠糖蛋白重新葡糖基化的主要酶。Uggt1 基因敲除小鼠表现出胚胎致死性，这证明了 UGGT1 在机体水平的重要性。

研究对象、材料和方法

1. 临床和遗传研究：研究遵循赫尔辛基宣言原则，经招募机构审查委员会（IRBs）批准，所有研究参与者或其法定监护人提供书面知情同意。通过 GeneMatcher、100,000 Genomes Project、协作研究网络和临床医生确定受影响个体。这些家庭来自不同遗传背景，包括阿米什人、巴基斯坦人、欧洲人、沙特阿拉伯人、土耳其人和埃及人。收集家系图谱和详细表型数据，对部分个体进行脑磁共振成像（MRI）扫描回顾。提取血液 / 口腔样本 DNA，根据不同家庭情况进行基因组测序（GS）或外显子组测序（ES），筛选与疾病表型相关的变异，并进行共分离分析。
2. UGGT1 细胞重新葡糖基化测定：培养 HEK293 - 6E、ALG6^-/-、ALG6/UGGT1/2^-/-细胞，将细胞转染野生型 UGGT1、突变型 UGGT1 或与 α - 抗胰蛋白酶 1 的 Z 突变体（AAT - Z）共转染。通过一系列处理和实验步骤，包括细胞裂解、蛋白质沉淀、免疫沉淀等，使用 SDS - PAGE 凝胶和 PVDF 膜进行蛋白质检测，用 ImageJ 软件量化蛋白质水平，计算葡糖基化和活性百分比，并进行统计学分析。
3. 催化活性测定：按照先前描述的方法进行酶促测定，确保 UGGT1 突变体浓度一致。反应混合物包含特定底物、UDP - Glc、UGGT1 等，反应后通过高效液相色谱（HPLC）定量葡萄糖转移百分比。
4. 细胞培养：培养健康对照者和受影响个体的皮肤成纤维细胞。
5. UGGT1 定位研究：转染特定 C 末端 UGGT1^FLAG构建体后，收集细胞和培养基，进行免疫沉淀和蛋白质检测，计算 UGGT1 分泌百分比。对受影响个体的皮肤成纤维细胞也进行类似处理和检测。
6. 迷你基因剪接测定：使用迷你基因分裂 GFP 构建体进行迷你基因剪接测定，合成包含 UGGT1 基因特定外显子的参考和突变基因片段并克隆到构建体中，转染 HEK293 细胞后提取 RNA、生成 cDNA，进行 PCR 扩增和下一代扩增子测序，分析剪接模式。

结果

1. 遗传分析：最初在一名阿米什男婴中发现疾病，其表现出多种严重症状，经基因组测序确定 UGGT1 基因存在复合杂合变异。进一步研究 10 个无关家庭的 15 名受影响个体，鉴定出 9 个 UGGT1 变异，包括无义变异、插入或缺失变异和错义变异，这些变异均为超罕见或在 gnomAD v.4.1.0 中不存在，且大多与疾病共分离。其中，p.Arg1546^Ter变异在多个家庭中出现，为阿拉伯人群的创始人变异。此外，还发现一个家庭的 UGGT1 剪接位点变异意义不确定。
2. UGGT1 - CDG 的临床特征：15 名受影响个体来自不同种族，年龄各异，表型从胎儿死亡 / 婴儿期死亡、多器官系统受累到复杂的综合征性神经发育障碍不等。常见特征包括严重全球发育迟缓（global developmental delay，GDD）/ 智力残疾、畸形特征、小头畸形、癫痫、行为异常、先天性心脏病、泌尿生殖系统异常和肝胆异常等。神经影像学检查常显示异常，但无特异性。EEG 常显示异常，部分个体进行的临床碳水化合物缺乏转铁蛋白检测结果正常。
3. UGGT1 变异破坏葡糖基转移酶活性：通过细胞基础的葡糖基化测定和体外催化活性测定研究 UGGT1 变异的生物学意义。结果显示，多数变异导致 UGGT1 自身葡糖基化和 AAT - Z 转葡糖基化显著降低或缺失，部分变异对催化活性有显著影响，但不同变异在两种测定中的结果存在差异。
4. 细胞内 UGGT1 p.Arg1546^Ter水平因细胞外 UGGT1 分泌而降低：p.Arg1546^Ter变异虽不影响体外或细胞内葡糖基转移酶活性，但可能影响亚细胞定位和细胞外分泌。研究发现，该变异导致 UGGT1 大量分泌到培养基中，使细胞内 UGGT1 水平降低。
5. 迷你基因剪接测定表明 UGGT1 变异破坏 UGGT1 mRNA 剪接：p.Ala711Val 和 p.Arg1272His 变异虽在葡糖基化和催化活性测定中未显示明显影响，但通过迷你基因剪接测定发现，它们分别导致 UGGT1 mRNA 的异常剪接，包括外显子截断、移码和内含子保留等。

讨论

UGGT1 - CDG 是一种由双等位基因 UGGT1 变异引起的 CDG，具有特征性但可变的多系统表型，主要影响神经功能。它与其他 CDGs 有临床重叠，如 MOGS - CDG 和 MAN1B1 - CDG。UGGT1 蛋白结构中的不同结构域具有不同功能，其 C 末端的 ER 检索序列对其驻留在内质网至关重要。研究通过多种实验方法证实，多数 UGGT1 变异体的葡糖基转移酶活性显著降低或缺失，部分变异虽酶活性未降低，但通过影响 mRNA 剪接或导致蛋白质异常分泌而影响 UGGT1 功能，最终破坏 CRT/CNX 循环，导致错误折叠的糖蛋白积累，引发内质网应激。

疾病严重程度与 UGGT1 活性存在基本相关性，双等位基因无效等位基因个体表现出更严重的表型，甚至胎儿死亡 / 婴儿期死亡；而携带错义变异且保留一定酶活性的个体则可能存活至婴儿期后，但存在神经发育障碍。传统的 N - 连接糖基化 CDGs 的主要分子诊断方法是检测血液中异常转铁蛋白糖基化模式，但 UGGT1 - CDG 患者的转铁蛋白分析可能显示正常模式，这表明遗传检测在临床怀疑 CDG 时的重要性。目前，CDGs 的治疗主要是支持性的，早期诊断对优化患者预后至关重要。本研究定义了双等位基因 UGGT1 改变是一种严重多系统表型的 CDG 的遗传原因，但仍需进一步研究其全表型谱、基因型 - 表型相关性以及糖补充治疗的潜在益处。