优化 RNA 提取及通用核糖体 RNA 去除技术评估根际微生物活性：开启土壤健康研究新征程

为解决从根际土壤提取高质量 RNA 及去除核糖体 RNA（rRNA）的难题，研究人员开展优化 RNA 提取和 rRNA 去除技术研究。结果显示优化方法提高了 RNA 产量和质量，成功组装转录本。该研究有助于推进土壤健康评估及理解植物 - 微生物 - 病原体相互作用。

　　在神奇的土壤世界里，植物根系周围有一片神秘区域 —— 根际。根际中的微生物就像一群勤劳的小卫士，对植物的生长、健康和产量起着至关重要的作用。它们不仅能帮助植物吸收营养，还能为植物抵御各种生物和非生物的威胁。然而，一旦根际微生物群落的组成或功能发生变化，就可能给植物带来意想不到的影响。所以，深入了解根际微生物的功能动态，成为了科学家们迫切需要攻克的难题。

以往，研究人员主要通过对特定 DNA 标记进行测序来研究土壤微生物，但这种方法存在一定的局限性。后来兴起的全基因组鸟枪法测序（WGSS）虽然有所进步，但基于 RNA 的测序在检测微生物方面更具优势，它能直接反映微生物在群落中的活跃程度。于是，元转录组学（Metatranscriptomics）应运而生，它可以捕捉微生物群落中活跃转录的基因，从而分析微生物在不同条件下的功能变化。

不过，元转录组学的研究之路并不平坦。首先，从根际土壤中提取高质量的 RNA 就困难重重。土壤中存在的酚类物质，如腐殖酸，在提取过程中容易与 RNA 共纯化，干扰后续的分子实验。而且土壤中到处都是强大的 RNA 核酸酶，这就要求 RNA 提取必须在高度严格控制的环境下进行。现有的商业试剂盒不仅成本高昂，而且缺乏灵活性，难以适应不同类型的土壤。其次，从总 RNA 样本中去除高度丰富的核糖体 RNA（rRNA）也颇具挑战，因为原核生物和真核生物的 RNA 动态存在差异，传统的文库制备方法很难从复杂的混合样本中有效去除 rRNA。

为了突破这些困境，美国阿肯色州立大学（Arkansas State University）的研究人员勇敢地踏上了探索之旅。他们开展了一项旨在优化从植物根际提取 mRNA 并进行通用 rRNA 去除的研究，期望获得适合 Illumina 测序的无 rRNA 样本。

研究人员在此次研究中用到了多个关键技术方法。首先是样本采集，他们从阿肯色州立大学农业教学与研究中心采集大豆根际土壤。接着在 RNA 提取与纯化环节，优化了基于十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）的酚 - 氯仿提取方法。然后利用 Zymo - Seq RiboFree Total RNA Library Kit 进行 RNA 测序文库构建，最后通过一系列生物信息学工具对 Illumina 测序数据进行分析。

下面来看看具体的研究结果：

1. 高质量 RNA 样本的获取：研究人员利用优化后的提取方案，从根际土壤中成功获得了高质量的 RNA 样本。通过 Qubit 4 荧光计和 NanoDrop 微量分光光度计检测发现，样本的核酸浓度和纯度指标良好，虽然部分样本的 Abs 260/230 比值受土壤中酚类、盐类等杂质影响，但所有样本的 RNA 完整性数（RIN_e）均大于 8，表明 RNA 质量较高，适合后续实验。此外，利用 Zymo - Seq RiboFree Total RNA Library Kit 制备的测序文库也通过了质量控制测试。
2. rRNA 的有效去除：研究人员使用 SortMeRNA 软件成功去除了大部分 rRNA，使 rRNA 水平从超过 90% 降低到 10% 以下。经过 rRNA 去除后，利用 rnaSPAdes assembler 将预处理后的短读长序列组装成了 190 万个重叠群（contigs），最长的 contig 长度达到 57,272 nt，E90 N50 指标显示覆盖 90% 表达的 contig 中位数长度为 266 nt，且样本的比对率在 30% - 51% 之间。
3. 根际微生物群落的分析：通过对组装转录本的分析，研究人员发现大部分转录本（87%）能在 UniProt 数据库中找到匹配序列，其中 52% 的序列与数据库中的现有序列相似度超过 90%。在分类注释方面，86% 的 contigs 获得了分类，细菌来源的 contigs 占比最大（98.79%），主要属于放线菌门（Actinomycetota）、变形菌门（Pseudomonadota）和酸杆菌门（Acidobacteriota）。此外，67% 的 contigs 成功分配到了至少一个基因本体（GO）术语，从功能上揭示了这些序列的生物学作用。进一步对细菌转录本的功能注释发现，跨膜转运、DNA 模板转录调控和蛋白水解是最丰富的生物学过程，ATP 结合、金属离子结合和 DNA 结合是最主要的分子功能。

在研究结论和讨论部分，研究人员成功优化了基于 CTAB 酚 - 氯仿的 RNA 提取方法，显著提高了富含粘土土壤中 RNA 的产量和质量，优于先前发表的方法和商业试剂盒。同时，利用 Zymo - Seq RiboFree Total RNA Library Kit 优化了元转录组文库制备方法，该试剂盒的通用 rRNA 去除步骤避免了原核和真核样本分别制备文库的繁琐过程。研究还表明，低成本的短读长测序能够有效地从多样的微生物群落中组装转录本，但增加测序深度有助于更全面地捕捉微生物转录本的多样性和复杂性。此外，选择合适的数据库对于提高组装转录本的注释准确性至关重要。

这项研究发表在《BMC Methods》上，为研究根际微生物提供了一种有价值的方法，有助于推动土壤健康评估的发展，加深人们对植物 - 微生物 - 病原体相互作用的理解，为可持续农业实践提供了重要的理论支持，有望减少农业生产对化学投入的依赖，通过微生物解决方案实现农业的可持续发展。