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为解决传统原位杂交方法需高温或甲酰胺处理损伤染色质结构、实验时间长以及 CRISPR-FISH 依赖荧光显微镜等问题，研究人员开展 CRISPR-Cas9 介导的显色原位 DNA 检测（CRISPR-CISH）方法研究，结果显示该方法能有效检测高拷贝重复序列，意义重大。
在生命科学的研究领域中，DNA 检测技术一直是探索微观世界奥秘的关键钥匙。荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization，FISH）和显色原位杂交（Chromogenic in situ hybridization，CISH）作为常用的 DNA 检测方法，虽各有优势，但也存在不少令人头疼的问题。FISH 需要借助荧光显微镜，这就好比出行必须开豪车，对很多资源有限的实验室来说是个沉重负担；而传统原位杂交方法，在进行探针杂交前要对 DNA 进行高温或甲酰胺处理，这就像给 DNA “洗热水澡”，会破坏染色质结构，还延长了获得实验结果的时间。
为了突破这些困境，来自德国莱布尼茨植物遗传学和作物植物研究所以及其他相关机构的研究人员，踏上了研发新方法的征程。他们的研究成果 ——CRISPR/dCas9 介导的显色原位 DNA 检测（CRISPR-Cas9-mediated chromogenic in situ DNA detection，CRISPR-CISH）方法，发表在了《Chromosome Research》上，给该领域带来了新的曙光。
研究人员为开展此项研究，运用了多种关键技术方法。在样本制备上，他们精心准备了拟南芥（Arabidopsis thaliana）、玉米（Zea mays）等多种动植物的细胞核和染色体样本。实验过程中，采用了 CRISPR 相关技术，如制备重组 dCas9、设计特定的 crRNA 和 tracrRNA 形成成熟 gRNA ，并结合显色检测技术，利用链霉亲和素碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶产生显色信号。
下面来看看具体的研究结果。在应用抗 Cas9 检测 dCas9 结合位点方面，研究人员将免疫荧光与标准 CRISPR-FISH 相结合，开发了一种间接 CRISPR-FISH 方法，成功检测到了拟南芥着丝粒和玉米节瘤重复序列，证明了该间接方法的可行性。在尝试用非荧光标记替代荧光标记检测 dCas9 结合位点时，研究人员利用碱性磷酸酶检测目标序列，发现苏木精作为染色质复染剂时，在拟南芥中会掩盖 CRISPR - 基于着丝粒的信号，但在玉米中染色效果相对较好。不过，整体来看，这种间接检测方法效率较低。
为找到合适的染色质复染剂，研究人员对多种染料进行测试。结果发现，在玉米、蚕豆（Vicia faba）和大葱（Allium fistulosum）中，4% 亚甲基绿、2% 甲基绿等部分染料能有效染色，其中中性红和苏木精对核周边染色清晰；而在拟南芥中，只有苏木精和亚甲基蓝能有效染色，但二者都会强烈染色染色中心，不适合作为复染剂。这表明要根据显色底物选择合适的复染剂，且染色质复染能力可能与物种基因组大小有关。
生物素化 tracrRNA 的应用大大提升了间接 CRISPR-ISH 的效率，也为 CRISPR-CISH 的实现奠定了基础。使用生物素化 tracrRNA 结合链霉亲和素标记的 FITC 进行间接 CRISPR-FISH，检测效率令人满意。在此基础上发展而来的 CRISPR-CISH，分别使用链霉亲和素结合碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶及相应显色底物，结果显示辣根过氧化物酶产生的信号更清晰、背景更低。CRISPR-CISH 能成功标记甲醛或 3:1 固定的细胞核和染色体中的重复序列，在不同物种的相关实验中均得到了验证。
综合来看，CRISPR-CISH 为 DNA 检测带来了新的突破。与传统方法相比，它无需昂贵的荧光显微镜，实验时间更短，操作条件温和，非常适合在教育机构和资源有限的实验室开展相关研究。虽然它还存在一些局限性，如受 NGG PAM 序列限制、对低拷贝和单拷贝序列标记效率较低等，但这并不影响它在未来研究和诊断应用中的巨大潜力。随着技术的不断发展，有望通过使用工程 Cas9 变体和结合其他方法进一步优化，为生命科学研究和健康医学领域的发展注入新的活力。
