融合超嗜热脱氢酶与天然电子介质构建高稳定性直接电子转移型酶传感器，助力第三代生物传感器新突破

为解决第三代生物传感器中使用嗜温生物酶的稳定性局限问题，研究人员开展了构建稳定的直接电子转移（DET）型脱氢酶的研究。他们成功制备 mPaeASD-cytb562融合蛋白，其具备高效 DET 能力且稳定性高，为第三代生物传感器开发提供新方向。

　　在生物传感器的发展历程中，电化学酶传感器逐渐成为各领域检测样本成分的得力助手。它能通过电极将酶促反应中底物的变化转化为电信号，依据氧化还原酶从底物提取电子并传递到电极的原理，实现对底物浓度的检测。历经三代发展，第一代生物传感器通过检测氧化酶消耗的氧气或产生的过氧化氢来测定底物，但样本溶液中氧气浓度差异易导致检测误差；第二代借助介导电子转移（MET）反应促进酶与电极间的电子传递，然而氧化还原介质易渗漏到样本溶液、酶 - 电极界面存在扩散屏障，影响了传感器的稳定性和重现性。如今，第三代生物传感器成为研究焦点，它以直接电子转移（DET）酶为电极元件，无需氧气分子或氧化还原介质，有望突破前两代的局限。但目前适用于 DET 的氧化还原酶有限，已报道的 DET 系统中使用的 MET 型酶多来自嗜温菌，稳定性差，不适合长期使用或储存。

在此背景下，日本福井大学、香川大学、大阪工业大学等机构的研究人员展开了一项重要研究。他们致力于开发一种新型、稳定的 DET 型酶，以推动第三代生物传感器的发展。研究人员将超嗜热古菌 Pyrobaculum aerophilum 的 MET 型醛糖脱氢酶（mPaeASD）与天然电子转移蛋白细胞色素 b₅₆₂（cyt b₅₆₂）融合，构建了 mPaeASD-cyt b₅₆₂重组蛋白表达系统。研究发现，该融合蛋白展现出高效的 DET 能力，且在 4°C 储存 2 个月后仍能保留超 80% 的初始电流响应，稳定性极高。这一成果意义重大，为第三代生物传感器的开发提供了极具潜力的新元件，有望推动生物传感器领域取得新的突破，相关研究成果发表在《Biotechnology Letters》上。

研究人员开展此项研究时，运用了多种关键技术方法。在构建表达载体方面，合成特定基因片段并经 PCR 扩增、酶切连接等操作构建 pET11amPaeASD-cyt 质粒。表达和纯化重组蛋白时，将构建好的质粒转化至大肠杆菌 BL21CodonPlus (DE3)-RIPL 中诱导表达，再经超声破碎、离心、镍柱亲和层析等步骤进行纯化。通过 UV - VIS 分光光度计测定融合蛋白的酶活性和吸收光谱，利用循环伏安法（CV）结合丝网印刷碳电极（SPCE）评估融合蛋白的 DET 能力和存储稳定性。

研究结果

1. DET 型 mPaeASD-cyt b₅₆₂的设计与融合蛋白表达：研究人员成功构建了 mPaeASD-cyt b₅₆₂重组蛋白表达系统，使 mPaeASD 与 cyt b₅₆₂通过 16 个氨基酸残基的柔性连接肽相连。转化后的大肠杆菌呈现典型的血红素红色，纯化后的蛋白经 SDS - PAGE 分析，分子量与预期的 mPaeASD-cyt b₅₆₂融合蛋白（55kDa）相符，表明 cyt b₅₆₂在大肠杆菌中正确表达。
2. mPaeASD-cyt b₅₆₂融合蛋白的氧化还原活性：以 2,6 - 二氯靛酚（DCIP）为电子受体测定融合蛋白的 PQQ - ASD 活性，发现其比活性为 1.33 units mg^-1 ，低于未融合 cyt b₅₆₂的 mPaeASD（11 units mg^-1）。光谱分析显示，向氧化态的融合蛋白中加入葡萄糖后，在 540 和 560nm 处出现对应还原血红素分子 Q 带的吸光度增加，证实电子从葡萄糖经 mPaeASD 中的 PQQ 转移到 cyt b₅₆₂的血红素分子。
3. mPaeASD-cyt b₅₆₂的 DET 能力：循环伏安法（CV）检测显示，单独的 mPaeASD 对葡萄糖的电流响应微弱，而 mPaeASD-cyt b₅₆₂融合蛋白则呈现出显著的葡萄糖浓度依赖性电流增加。以 mPaeASD-cyt b₅₆₂为电极元件，测定 d - 葡萄糖的表观 K_m为 53.8mM，最大电流（I_max）为 17.1μA/cm² ，表明该融合蛋白具有高效的 DET 能力。且在 4°C 储存 2 个月后，其电流响应仍能保留初始的 80% 以上，展现出良好的存储稳定性。

研究结论与讨论

研究人员成功构建了结合超嗜热 MET 型脱氢酶 mPaeASD 和天然电子转移蛋白 cyt b₅₆₂的融合蛋白，实现了从葡萄糖到 cyt b₅₆₂血红素的分子内电子转移，并证实该融合蛋白具备高效的 DET 能力和高稳定性。这一成果为第三代生物传感器的开发提供了新的方向，有望克服传统生物传感器的稳定性问题，推动生物传感器在临床诊断、食品分析、环境评估等领域的广泛应用。此外，研究中使用的超稳定 MET 型脱氢酶为开发更稳定的 DET 型酶提供了思路，未来可能促进其他热稳定 MET 型脱氢酶与 cyt b₅₆₂结合，用于开发新型电化学装置。