综述：光学镊子实验中蛋白质折叠自由能研究

这篇综述系统探讨了单分子操纵技术（如光学/磁镊（OT/MT）和原子力显微镜（AFM））结合非平衡自由能定理（Jarzynski等式、Crooks涨落定理等）在蛋白质折叠自由能（ΔG）研究中的应用。文章揭示了不同方法测得的自由能差异可能源于折叠路径中的中间态（如熔球态），为解析蛋白质动态机制提供了新视角。

　　

Abstract

自由能作为化学反应平衡的核心参数，传统通过改变温度或变性剂浓度等宏观实验测定，但耗时且需严格平衡条件。单分子操纵技术的突破使直接测量蛋白质在特定力下的解折叠/重折叠功成为可能。结合Jarzynski等式和Crooks涨落定理等非平衡热力学工具，研究者能从远离平衡的实验数据中提取自由能值。光学镊子技术因其高精度力控（pN级）和实时监测优势，成为解析蛋白质折叠动力学的利器。

方法论比较

光学镊子通过激光捕获微球施加机械力，配合力-延伸曲线（FEC）记录构象变化。Jarzynski等式利用多次非平衡功的指数平均估算自由能，而Crooks定理通过正向/逆向功分布交叉验证。Bennett接受比（BAR）和重叠分布法则（Overlap method）则优化了数据利用率。值得注意的是，不同方法对同一蛋白（如T4溶菌酶）的ΔG测算存在10-15%差异，暗示传统双态模型（native/unfolded）可能遗漏了熔球态（molten globule）等短暂中间态。

折叠路径的复杂性

核糖核酸酶A（RNase A）的实验中，力速依赖的ΔG偏移揭示了力诱导的折叠路径重构。当加载速率>1 pN/s时，部分折叠中间态被力场"冻结"，导致表观自由能升高。分子动力学模拟显示，这些中间态具有局部二级结构但缺乏三级接触，符合熔球态特征。类似现象在肌联蛋白（titin）的Ig结构域中也被观察到，提示机械力可能暴露了传统溶剂变性实验中隐藏的能垒。

挑战与展望

当前技术局限包括：1）高力（>30 pN）导致的共价键断裂；2）缓冲液粘度对弛豫时间的干扰；3）荧光标记对天然构象的潜在影响。未来结合低温电子显微镜（cryo-EM）和深度学习预测，有望构建多尺度折叠景观图。特别需要关注伴侣蛋白（chaperone）在生理条件下的调控作用，这可能是体外单分子实验与细胞内折叠效率差异的关键。