NOTCH4内含子28调控元件通过SOX17介导的动脉特化和淋巴发育机制调控hPSCs造血分化

研究人员针对NOTCH信号通路在动脉特化和淋巴发育中的关键作用，通过单细胞多组学分析揭示了人类多能干细胞(hPSCs)造血分化过程中NOTCH4内含子28调控元件(NOTCH4in28)通过SOX17结合调控动脉内皮特征形成和T/NK淋巴细胞发育的分子机制。该研究首次鉴定出NOTCH4in28这一具有增强子特性的顺式调控元件，其缺失会显著损害DLL4+CXCR4+/?动脉型造血内皮(HE)的形成及淋巴祖细胞潜能，为造血发育调控提供了新见解，并为hPSCs定向分化生成免疫细胞提供了新策略。

　　

在胚胎发育过程中，造血干细胞(HSCs)和淋巴细胞起源于具有动脉特征的造血内皮(HE)，这一过程高度依赖NOTCH信号通路的精确调控。尽管已知NOTCH1在造血发育中起核心作用，但NOTCH4的功能及其调控机制仍存在重大知识空白。特别是在人类多能干细胞(hPSCs)定向分化体系中，如何通过表观遗传调控实现NOTCH4的时空特异性表达，进而影响动脉特化和淋巴发育，成为领域内亟待解决的关键科学问题。

为揭示这一机制，研究人员开展了系统性研究。通过单细胞RNA测序(scRNA-seq)和转座酶可及染色质测序(ATAC-seq)的多组学分析，追踪了hPSCs向造血细胞分化过程中NOTCH信号通路的动态变化。研究团队构建了NOTCH4内含子28报告系统，采用CRISPR/Cas9基因编辑技术创建NOTCH4in28缺失细胞系，并结合染色质免疫沉淀(ChIP)和荧光素酶报告实验验证调控元件的功能。样本来源于H9人胚胎干细胞(hESCs)分化体系及脐带血(CB)CD34⁺细胞。

多组学分析揭示了动脉程序激活的动态过程。研究发现D5分化阶段出现具有动脉特征的DLL4⁺CXCR4^+/? HE群体，伴随着NOTCH4表达上调。SCENIC+分析鉴定出MECOM、FOXO1和MEF2C等调控网络在动脉内皮中的特异性激活。值得注意的是，NOTCH4内含子28区域(32196422-32196924)存在两个高度保守的SOX17结合位点，其染色质可及性与动脉特征形成呈正相关。

NOTCH4in28被证实为功能增强子元件。ChIP-qPCR显示SOX17结合伴随H3K27ac和H3K4me1组蛋白修饰的富集。报告基因实验证实503bp的NOTCH4in28片段具有DOX诱导的增强子活性，而缺失295bp(含SOX17位点)的片段则丧失此功能。将NOTCH4in28-β-globin-VENUS报告系统整合至AAVS1位点后，在D7动脉内皮中观察到最强的Venus信号。

基因编辑验证了NOTCH4in28的生物学功能。NOTCH4^{Δin28?/Δin28?} hPSCs表现出动脉标志物(DLL4、CXCR4)表达下降，HE中NOTCH4蛋白水平降低约50%。在iSOX17条件性表达体系中，SOX17诱导的NOTCH4上调完全依赖于NOTCH4in28元件的完整性。qPCR证实NOTCH4in28缺失导致下游靶基因HEY1表达显著下调。

关键发现是NOTCH4in28调控淋巴发育。NOTCH4^{Δin28?/Δin28?} hPSCs衍生的造血祖细胞(HPs)在OP9-DLL4共培养体系中，T细胞(CD5⁺CD7⁺和CD4⁺CD8⁺)和NK细胞(CD56⁺)产量减少70%-80%。iSOX17/<NOTCH4^{Δin28?/Δin28?}双突变体证实，SOX17促进的淋巴系分化潜能完全依赖于NOTCH4in28介导的NOTCH4表达调控。

该研究首次阐明NOTCH4在人类动脉特化和淋巴发育中的独特作用，揭示了SOX17-NOTCH4in28-NOTCH4这一新的调控轴。相较于小鼠模型，人类NOTCH4表现出更显著的淋巴发育调控功能，提示可能存在物种特异性调控机制。从转化医学角度看，这一发现为优化hPSCs定向分化生成T/NK淋巴细胞提供了新的分子靶点，对发展基于干细胞的免疫细胞治疗策略具有重要指导意义。研究建立的NOTCH4in28报告系统可作为筛选动脉特化促进因子的有力工具，而相关调控机制的解析为造血发育异常疾病的诊治提供了新思路。论文发表在《Blood Vessels, Thrombosis》期刊，为NOTCH信号通路研究开辟了新视角。