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本文聚焦基于体外 T7 RNA 聚合酶反应的生物传感策略，涵盖荧光、电化学、比色及与 CRISPR/Cas 系统整合等多种检测方法，介绍其原理、优势与挑战，展现 T7 RNA 聚合酶在生物传感中的关键作用，为相关研究提供参考。
1. 引言
RNA 分子在细胞内与多种核酸、蛋白质和小分子相互作用，发挥着至关重要且多样的调控作用。受此启发，研究人员致力于改造 RNA 分子，赋予其新的生物学功能。近年来，合成生物学取得显著进展，开发出能在体内调控基因表达的创新合成 RNA 元件，主要应用于细菌和酵母系统。不过，该领域仍面临挑战，如借助计算和定向进化方法提升工程化 RNA 系统的复杂性，以及将其应用拓展到哺乳动物系统等。同时，设计可作为细胞内和环境信号传感器的 RNA 分子，以及用于研究生物网络和工程细胞调控系统关键组件的探针，也是当前的研究热点。因此，理解 RNA 合成在合成生物学研究中意义重大。
自体外 RNA 合成的酶促过程问世以来，T7 RNA 聚合酶在研究和商业领域得到广泛应用。该酶源自 T7 噬菌体，可催化 DNA 模板在 5'→3' 方向合成 RNA。其转录过程包括启动子识别、启动子延伸、转录和终止等多个阶段。T7 RNA 聚合酶对其启动子具有高度特异性，仅转录 T7 启动子序列下游的 DNA。凭借这些独特特性，它在揭示基本生物学机制、生产重组蛋白、开发 RNA 疗法及推进生物传感技术等诸多领域，都成为了不可或缺的工具。
在核酸研究尤其是生物传感应用中，T7 RNA 聚合酶因其强大且特异的活性备受青睐。与 DNA 聚合酶相比，它的一大显著优势是能够从单个 DNA 模板连续等温地生成多条 RNA 链，这一特性使其在直接和间接生物传感中都极具价值。在间接生物传感中，T7 RNA 聚合酶生成的 RNA 可用于后续步骤，比如产生用于生物传感的 crRNA；在直接生物传感中，它可捕获生物分子，或基于 DNA 模板与分析物之间的相互作用发挥作用。这些能力使得 T7 RNA 聚合酶成为基于 RNA 的生物传感技术的关键工具。
本研究旨在综述现有的基于 T7 RNA 聚合酶的生物传感器，这些传感器可用于可靠、高效地检测各种分析物。目前，已开发出多种结合荧光适配体、电化学探针或 CRISPR/Cas 系统的 T7 RNA 聚合酶生物传感器。此外，本文还将探讨这些方法的优势与面临的挑战，全面概述基于 T7 RNA 聚合酶的生物传感器技术现状，为该领域未来的研究与发展提供指导。
2. 体外 T7 RNA 聚合酶作为生物传感器
T7 RNA 聚合酶反应是 RNA 合成的核心过程，利用源自 T7 噬菌体的 T7 RNA 聚合酶从 DNA 模板转录 RNA。该转录过程包含三个关键阶段：启动子识别、转录和终止。首先，T7 RNA 聚合酶特异性识别并结合到一段短而明确的启动子序列上，该序列通常位于待转录基因的上游。启动子序列对于启动转录至关重要，它确保酶仅转录 T7 启动子下游的 DNA。结合后，聚合酶通过在 5' 到 3' 方向掺入与 DNA 模板互补的核苷酸，开始 RNA 合成。在脱离启动子后，酶进入延伸阶段，在此期间，它合成连续的 RNA 链，并维持稳定的延伸复合物。T7 RNA 聚合酶在延伸过程中具有高度的持续性，能够在不脱离模板的情况下产生长链 RNA 分子。当聚合酶到达特定的终止信号或模板末端时，终止发生，新合成的 RNA 转录本被释放。这一高效且精简的过程，无需额外的转录因子，使 T7 RNA 聚合酶成为体外可控转录的理想酶，其持续性和精确性使其在众多应用中发挥着关键作用。
T7 RNA 聚合酶具有独特的能力，虽然转录起始需要双链 DNA（dsDNA）启动子，但它能够从单链 DNA（ssDNA）模板转录 RNA。这种特异性源于酶必须首先结合到完全双链的启动子区域，该区域通常从转录起始位点的约 -17 延伸到 +1。一旦结合并启动转录，T7 RNA 聚合酶就可以使用 ssDNA 作为模板继续延伸，这使其具有高度的通用性。在仅需模板极小部分为双链的情况下，这种特性可实现高效的 RNA 合成，简化了实验设计，降低了模板制备的要求。聚合酶在结合启动子后能够在 ssDNA 模板上发挥作用，也增强了其在合成生物学和生物传感应用中的实用性，可高效产生定制的 RNA 序列。
基于 DNA 的生物传感在防范危险生物分子和病原体感染方面发挥着关键作用。然而，传统的基于 DNA 的生物传感器往往在灵敏度和特异性方面存在局限。体外 T7 RNA 聚合酶反应通过转录实现信号放大，显著提高了灵敏度和特异性。其关键优势之一是能够精确控制和微调反应条件，实现精确的等温 RNA 合成，无需复杂的细胞机制。检测系统可在 T7 RNA 聚合酶活性的转录前、转录中和转录后阶段进行开发。在转录前阶段，分析物与 DNA 模板相互作用，影响转录反应；转录过程中，T7 RNA 聚合酶与分析物（如蛋白质或生物分子）之间的竞争也可用于生物传感；转录后阶段的 T7 RNA 聚合酶生物传感系统则依赖 RNA 转录产物作为与分析物相互作用的触发物，此阶段可发生多种相互作用，如 RNA 适配体 - 生物分子、RNA - DNA 和 RNA - RNA 相互作用，有助于开发高灵敏度和特异性的生物传感应用。此外，与体内 T7 RNA 聚合酶反应相比，体外反应消除了细胞干扰，降低了生物传感输出中的噪声和可变性。而且，体外 T7 RNA 聚合酶可轻松与其他生物传感平台整合，高特异性和灵敏地检测多种分析物。这种灵活性和可扩展性使体外 T7 RNA 聚合酶特别适合开发高效、灵敏且可编程的生物传感器。
3. T7 RNA 聚合酶生物传感器
3.1 基于荧光的 T7 RNA 聚合酶生物传感器
基于荧光的体外 T7 RNA 聚合酶生物传感利用该酶从 DNA 模板转录 RNA 的能力，生成的 RNA 分子与荧光适配体或染料相互作用，产生可测量的信号。其原理是 DNA 模板包含 T7 启动子序列，T7 RNA 聚合酶特异性识别并结合该序列启动转录。T7 启动子不仅用于下游的生物传感平台，还用于分析物检测电路。合成的 RNA 可设计包含与荧光分子结合的序列，如点亮型 RNA 适配体，结合后会发出荧光。这种基于荧光的方法能够实时监测转录过程，因为荧光强度与产生的 RNA 量成比例增加。该方法为跟踪 RNA 合成和量化 T7 RNA 聚合酶活性提供了有力工具，且无需复杂设备。
基于荧光输出的体外 T7 RNA 聚合酶生物传感策略采用基于分裂 T7 启动子的等温转录扩增系统，可快速、高特异性地检测 SARS-CoV-2。T7 RNA 聚合酶在此方法中起核心作用，只有当目标 RNA 在三向连接结构中形成完整的双链 T7 启动子时，它才会启动转录。这种设计使 T7 RNA 聚合酶能够转录点亮型 RNA 适配体，与荧光染料结合后产生强荧光信号。该系统可在 37°C 下 30 分钟内检测 SARS-CoV-2 RNA，在 60 例临床样本测试中，灵敏度高达 96.7%，特异性达 100%。通过靶向 SARS-CoV-2 基因组上的两个位点，该策略将检测灵敏度提高到 102 拷贝 /μL（167 aM），为即时诊断提供了一种快速、单酶检测方法。
另一种基于荧光输出的 T7 RNA 聚合酶生物传感策略使用高通量 iSpinach 荧光适配体系统，实时监测 T7 RNA 聚合酶的体外转录过程。T7 RNA 聚合酶的关键作用是从 DNA 模板启动转录，产生的 RNA 转录本随后与 iSpinach 适配体结合，与 DFHBI 染料结合后产生荧光信号。这种基于荧光的系统能够持续监测 RNA 生成，便于快速优化转录条件。该方法灵敏度高，荧光强度与 RNA 产量密切相关，可直接读出 T7 RNA 聚合酶的活性。
此前已展示了多种基于荧光输出的体外 T7 RNA 聚合酶生物传感策略。不过，该方法存在一些挑战，例如荧光适配体或染料通常需要精确折叠才能发出信号，但可能因二级结构或环境因素无法始终如一地与 RNA 相互作用，从而影响信号质量。
3.2 基于电化学的 T7 RNA 聚合酶生物传感器
基于电化学的体外 T7 RNA 聚合酶生物传感利用该酶在目标分子（如 DNA 或 RNA）存在时从 DNA 模板转录 RNA 的能力。当目标分子与传感器上的特定探针结合时，会触发包含 T7 启动子的双链区域形成。T7 RNA 聚合酶识别该启动子并转录 RNA，RNA 作为放大信号。RNA 产物与检测元件相互作用，产生电化学响应，通常通过测量电流或电位的变化来检测，该响应与目标浓度相关，实现高灵敏度检测。T7 RNA 聚合酶的特异性确保了低信噪比，使该方法非常适合在诊断等应用中检测核酸和其他生物分子。
基于电化学输出的体外 T7 RNA 聚合酶生物传感采用均相目标引发转录扩增系统，用于超灵敏地电化学检测致病性 DNA。T7 RNA 聚合酶在放大检测信号方面起着关键作用。目标 DNA 与特殊设计的发夹探针结合后，构象变化允许引物延伸反应，产生包含 T7 启动子的双链 DNA。T7 RNA 聚合酶识别该启动子，并从下游 DNA 模板转录大量 RNA 分子。这些 RNA 产物随后与生物传感器表面的探针杂交，促进酶放大的电化学读出。这一系列的放大过程显著提高了检测灵敏度，使系统能够检测极低浓度的 DNA，低至 0.97 fM。
另一种基于电化学输出的体外 T7 RNA 聚合酶生物传感方法采用缺陷 T 连接诱导转录扩增系统，利用 T7 RNA 聚合酶实现超灵敏的 DNA 电化学检测。当目标 DNA 结合形成缺陷 T 连接，产生双链启动子区域时，T7 RNA 聚合酶驱动转录扩增。该启动子区域使 T7 RNA 聚合酶产生大量单链 RNA 产物，随后与生物传感器表面的生物素化探针杂交，产生可测量的电化学信号。DTITA 方法在保持低背景噪声的同时实现了高信号放大，合成 DNA 的检测限低至 0.4 fM。该方法稳定性好，在不同检测中表现一致，且无需 PCR 即可成功检测临床样本中的 B 群链球菌 DNA。
此前已展示了多种基于体外 T7 RNA 聚合酶的电化学方法。尽管基于体外 T7 RNA 聚合酶的电化学生物传感在灵敏度和特异性方面具有优势，但仍面临一些挑战。一个主要问题是在反应过程中维持 T7 RNA 聚合酶的稳定性和活性，因为酶的降解或抑制会影响生物传感器的可靠性。另一个挑战是尽量减少非特异性结合，否则会导致背景噪声，降低检测的准确性。
3.3 基于比色的 T7 RNA 聚合酶生物传感器
基于比色检测的体外 T7 RNA 聚合酶生物传感是一种强大且灵敏的技术，通过利用酶的转录活性检测特定目标分子。在该方法中，当存在目标分子（如 DNA 序列、RNA 或蛋白酶等蛋白质）时，T7 RNA 聚合酶在无细胞的受控环境中从 DNA 模板转录 RNA。转录的 RNA 随后触发比色反应，通常涉及产生可见颜色变化的材料或酶系统。颜色变化是由于 RNA 与比色试剂之间的相互作用，如纳米颗粒的聚集或显色底物的激活，使溶液颜色发生改变，常见的是从红色变为蓝色。这一过程无需复杂设备，通过肉眼或简单装置即可观察颜色变化，实现对目标分子的简便、快速且高灵敏度检测。该系统的体外性质确保了对反应条件的精确控制，提高了特异性，减少了其他生物成分的干扰。总体而言，基于 T7 RNA 聚合酶的比色生物传感因其简单性、可扩展性和通用性，在诊断和研究中得到广泛应用。
在体外转录 / 翻译测定中利用 T7 RNA 聚合酶，结合无细胞蛋白质合成平台，可实现基于比色输出的高效 RNA 检测。借助 T7 RNA 聚合酶对其启动子的特异性，该测定能够精确转录合成样本中的病毒 RNA，最终放大检测信号。这种方法的一个关键优势是可在室温下操作，成本效益高，适用于资源有限的环境，尤其是发展中国家。该系统灵敏度高，能够检测低至 110 aM 的 RNA 浓度，相当于每个反应约 667 个 RNA 拷贝。该平台为核酸诊断提供了低成本（每次测试约 0.26 欧元）的解决方案，且有进一步优化以降低成本和提高可扩展性的潜力。
另一种基于 T7 RNA 聚合酶的比色生物传感策略采用分裂 T7 开关介导的无细胞蛋白质合成（CFPS）系统，可提高检测目标核酸的灵敏度和特异性。T7 RNA 聚合酶的关键作用是仅在目标核酸存在下，当分裂 T7 启动子形成完整双链结构时才启动转录，实现精确控制并减少背景噪声，这克服了以前 toehold 开关系统的局限性。该系统在等温条件下运行，检测限低至 10 pM，显著提高了检测效率。T7 RNA 聚合酶的选择性转录起始增强了平台的多功能性，可实现荧光和比色两种输出，适用于各种诊断应用。由 T7 RNA 聚合酶实现的一锅法设置简化了流程，使其适合现场诊断。
此前也展示了多种基于体外 T7 RNA 聚合酶的比色方法。基于比色检测的体外 T7 RNA 聚合酶生物传感面临一些关键挑战，如在最小化背景噪声的同时保持系统的灵敏度和特异性。实现仅在目标分子存在时才发生的高度选择性转录至关重要，因为意外或 “渗漏” 转录会导致假阳性，降低检测的准确性。此外，确保比色响应稳健且易于区分也颇具难度，尤其是在复杂样本中，其他物质可能干扰反应或掩盖颜色变化。优化试剂（如 T7 RNA 聚合酶转录的 RNA）的稳定性也是一个挑战，因为 RNA 可能随时间降解，影响检测的可靠性。
3.4 与 CRISPR/Cas 系统整合的 T7 RNA 聚合酶生物传感器
与 CRISPR/Cas 系统整合的体外 T7 RNA 聚合酶生物传感代表了生物传感领域一个充满前景的新方向，它结合了 T7 RNA 聚合酶用于转录扩增和 CRISPR/Cas 系统用于特异性目标识别及信号放大的独特优势。CRISPR/Cas 系统以其精确的靶向能力而闻名，近年来已成为强大的生物传感平台，能够高特异性和灵敏地检测核酸。在这些整合系统中，当特定目标序列或分析物触发激活时，T7 RNA 聚合酶从 DNA 模板转录 RNA，产生的 RNA 随后被 CRISPR 相关蛋白（如 Cas12a 或 Cas13a）检测或切割。这种双酶方法实现了显著的信号放大，通常产生与目标浓度直接相关的可检测读数，如荧光或电化学变化。CRISPR/Cas 系统可适应多种信号输出方式，如荧光、电化学和比色，使其在病原体检测、环境监测和诊断等多种应用中具有通用性。尽管作为生物传感平台相对较新，但在无细胞体外设置中与 T7 RNA 聚合酶的整合，展示了一种强大的模块化方法，可实现灵敏、实时的检测，为创新诊断工具的开发开辟了道路。
整合了 T7 RNA 聚合酶的 CRISPR/Cas 系统已通过 “熵驱动触发 T7 扩增 - CRISPR/Cas13a 系统”（EDT - Cas）应用于 SARS-CoV-2 检测，结合 T7 RNA 聚合酶和 CRISPR/Cas13a 提高了检测灵敏度。T7 RNA 聚合酶在此过程中起着关键作用，熵驱动的循环扩增产生 T7 启动子后，它启动目标 SARS-CoV-2 RNA 的转录。这一过程产生大量单链 RNA（ssRNA），进一步激活 CRISPR/Cas13a，使其能够特异性切割电极表面的报告探针。由此产生的 ECL 信号放大可检测极低浓度的 SARS-CoV-2 RNA，检测限低至 7.39 aM，展示出高灵敏度和重复性。
另一种生物传感策略采用由 T7 RNA 聚合酶驱动转录扩增增强的 CRISPR/Cas12a 核酸传感平台，用于高灵敏度核酸检测。T7 RNA 聚合酶在该系统中至关重要，当目标核酸与邻近探针形成三向连接结构时，它启动转录。这种结构使 T7 RNA 聚合酶能够产生大量 crRNA 分子，随后与 Cas12a 和 dsDNA 激活剂组装形成复合物，触发 Cas12a 的反式切割活性。这种级联效应显著放大了荧光信号，检测限低至 41.7 amol。这种双步放大方法不仅提高了平台的灵敏度，还降低了非特异性背景信号，实现了对 DNA 和 RNA 目标均适用的高精度核酸检测。
基于 CRISPR/Cas 系统的体外 T7 RNA 聚合酶生物传感面临独特挑战，特别是由于涉及 T7 RNA 聚合酶和 CRISPR 相关蛋白（如 Cas12a 或 Cas13a）的双酶机制。这种双酶设置增加了操作成本，因为两种酶的生产和纯化成本较高，并且需要精确的反应条件来维持最佳活性，增加了工作流程的复杂性。此外，使用两种酶较为耗时，需要 T7 RNA 聚合酶转录目标 RNA，然后激活 CRISPR/Cas 反应进行信号检测的顺序步骤。确保这些酶促活性的兼容性，尤其是在受控的无细胞环境中，需要仔细优化温度、缓冲液成分和离子浓度等条件，以避免灵敏度损失或产生假阳性信号。
4. 结论
基于体外 T7 RNA 聚合酶的生物传感策略，包括基于荧光、电化学、比色以及与 CRISPR/Cas 系统整合的检测方法，均已得到
