工程化互作元件驱动的多酶组装与级联生物催化提升靛蓝合成效率

针对多酶组装策略中互作元件匮乏的瓶颈，研究人员创新性地开发了源自流感病毒的PB1C/PB2N肽对和importin/PB2C蛋白-肽互作系统，结合RIDD/RIAD体系构建高效蛋白支架。该研究通过优化靛蓝合成途径的级联生物催化（cascade biocatalysis），实现靛蓝产量翻倍，为复杂代谢通路的空间调控提供了新型分子工具包。

　　

在微生物细胞工厂构建领域，高效生产高附加值天然产物面临重大挑战——复杂代谢途径需要精确调控多个酶的时空分布。自然界通过形成多酶复合体（如细胞ulosome、purinosome等）实现底物通道效应（substrate channeling），但人工构建这类系统却受限于互作元件的稀缺性。现有支架如DNA/RNA易受环境影响，而蛋白支架虽具遗传编码优势，但可用元件仅有SH3结构域、SpyCatcher/SpyTag等有限选择。这种局限性严重阻碍了合成生物学在代谢工程中的应用深度。

为解决这一关键问题，沈阳某高校研究团队创新性地挖掘流感病毒蛋白互作网络，首次将病毒来源的PB1C/PB2N肽对和importin/PB2C系统应用于酶组装领域。该研究以靛蓝生物合成为模型，通过融合这些新型互作元件到单加氧酶（IifC）和黄素还原酶（IifD）上，结合GalDH（半乳糖脱氢酶）构建级联反应体系。研究采用分子克隆技术构建重组质粒，通过自适应实验室进化（ALE）获得高吲哚耐受的E. coli BL21(DE3)宿主，并运用光谱分析和HPLC定量评估产物产量。

【材料与方法】部分显示，团队采用无缝克隆技术构建了包含IifC（来自Acinetobacter calcoaceticus的单加氧酶）和IifD（黄素还原酶）的融合蛋白IifCD7，其与GalDH（Aspergillus niger来源）共同组成靛蓝合成途径。关键创新在于将PB1C（PB1蛋白678-757残基）与PB2N（PB2蛋白1-37残基）这对高亲和力肽段作为"分子胶水"，同时利用importinα与PB2C（PB2 C端区域）的"停靠-锁定"机制构建多维支架。

【结果与讨论】部分揭示：1）新型互作元件组装系统使靛蓝产量较传统共表达提升2倍，证实其有效促进底物通道效应；2）PB1C/PB2N因分子量小（<10 kDa）对酶活性影响极小，而importin/PB2C的非共价互作允许蛋白自由折叠；3）与RIDD/RIAD系统联用时可构建更复杂的空间拓扑结构。这些发现为代谢通量（metabolic flux）调控提供了新工具，特别适用于需要精确控制中间体扩散的毒害性代谢途径。

该研究的突破性在于：首次将病毒蛋白互作网络转化为合成生物学元件，扩展了酶组装工具箱的多样性。其开发的PB1C/PB2N标签具有短肽优势，而importin/PB2C系统则展现出动态组装特性，二者互补为不同场景提供解决方案。论文发表在《Bioresource Technology》的意义不仅在于提升靛蓝生产效率，更在于为萜类、生物碱等复杂天然产物的合成途径优化提供了普适性策略。未来通过组合不同互作元件，有望实现"即插即用"的模块化酶组装平台，推动绿色生物制造的发展。