pH 响应型腙键化学解锁双载荷释放：开启协同治疗新征程

细胞功能研究和协同治疗需求推动科研进展，研究人员聚焦 pH 响应型双载荷释放，合成六种酰腙连接子并评估稳定性。发现连接子 3 和 21 有应用潜力，这为细胞内精准递送治疗药物提供新策略，有望改善治疗效果。

　　在生命科学的微观世界里，细胞如同一个个精密运转的小工厂，而细胞内的各种细胞器则是工厂里各司其职的 “小车间” 。这些细胞器对于维持细胞乃至整个生物体的正常功能至关重要。然而，目前科学家们虽然对细胞器的功能有了不少了解，但仍有许多奥秘等待揭开。同时，为了深入探究细胞功能、精准调控细胞行为，将造影剂和治疗药物精准地递送到细胞内特定区域（即细胞内递送，Intracellular Delivery）的需求越来越迫切。

在细胞内递送领域，单药递送已经颇具挑战，当需要同时递送两种药物（双通路靶向）时，难度更是大幅增加，比如在多药耐药细胞的治疗中，如何突破细胞通透性障碍、实现多种药物的可控细胞内递送成为了亟待解决的难题。此外，纳米颗粒（NPs）虽然在改善细胞内递送方面展现出一定优势，能够保护包裹的药物在循环过程中不被降解，还能借助增强渗透和滞留效应在肿瘤部位富集，但大部分治疗药物的作用位点并非内体 / 溶酶体，如何让药物从内体中逃逸并在合适的时间释放药物以提高治疗效果，也是一大挑战。

为了解决这些问题，来自未知研究机构的研究人员开展了一项关于 pH 响应型双载荷释放的研究。他们设计并合成了一种酸不稳定的三功能酰腙连接子，这种连接子可以连接两种不同的载荷（分别称为载荷 W 和载荷 Z），并且能够在酸性条件下实现双载荷的顺序释放。研究结果表明，合成的六种目标酰腙连接子中，连接子 3 和 21 展现出了令人期待的释放特性，它们在生理 pH 下具有较高的稳定性，而在类似晚期内体、溶酶体（pH 4.5 - 5.5）或肿瘤部位（pH 6.5）的酸性环境中能够快速释放双载荷 。这一研究成果意义重大，为未来纳米颗粒偶联提供了理想的候选载体，有望实现细胞内多种药物的协同治疗，比如联合递送阿霉素（DOX）和一氧化氮（NO）供体，或者蛋白质、siRNA 与小分子药物，为多种疾病的治疗开辟新途径，该研究成果发表在《Bioorganic》上。

研究人员在研究过程中主要运用了以下关键技术方法：首先，通过化学合成方法制备了多种酰腙连接子；然后，利用核磁共振（NMR）技术对关键中间体和最终目标产物进行结构表征；最后，采用高效液相色谱（HPLC）结合吸收检测的方法，在不同 pH 值和生理温度下对连接子的水解稳定性进行评估 。

下面来详细了解一下研究结果：

1. 提出的释放机制：在酸性条件（pH 4.5 - 5.0）下，酰腙更易水解，释放出酮（载荷 W）和带有亲核胺的游离酰肼。亲核胺会与合适位置的亲电试剂（如酯）发生快速分子内反应，从而释放出载荷 Z。通过调整亲核胺与亲电试剂之间碳间隔的长度，可以控制载荷 Z 的释放速率。同时，该过程还会产生一些副产物，但在低浓度下不会产生毒性问题。
2. 连接子 1 和 2 的合成：研究人员尝试了两种方法合成连接子 1 和 2。第一种方法中，先制备带有 “替代” 酮的连接子，再与目标酮反应，但在反应过程中遇到了酰肼盐易环化、产物纯度低等问题；第二种方法虽然成功合成了部分中间体，但发现合成的酰腙在室温下就容易水解，这意味着基于烷基酮酰腙的连接子不适合用于药物递送。
3. 设计具有改进水解稳定性的酰腙连接子：为了设计出符合要求的酰腙连接子，研究人员深入研究了水解和腙形成的机制。他们发现，降低酰腙氮原子的电子密度或减少其亲电碳原子的固有亲电性可以稳定酰腙。基于此，他们提出通过在 R¹位置将酰腙 C¹=N¹ π 键与芳香 π 系统共轭来进一步稳定酰腙，并设计了一系列在 R²或 R³位置引入芳基的连接子。
4. 在 R¹位置带有芳基的酰腙连接子的合成：采用第二种方法成功合成了在 R¹位置带有芳基的连接子 3。该连接子在合成过程中表现出较好的稳定性，可以通过标准硅胶柱色谱法进行纯化，并且在短期储存中也能保持稳定。
5. 在 R²位置带有芳基的酰腙连接子的合成：虽然在 R²位置引入芳基的初衷是增强酰腙键的稳定性，但在合成过程中遇到了稳定性相关的挑战，未能成功合成目标连接子。
6. 在 R³位置带有芳基的酰腙连接子的合成：在 R³位置引入芳基时，发现会导致 O - 烷基化产物占主导，难以得到所需的 N - 烷基化产物。通过调整结构，在苯基环和羰基之间插入特定功能基团，部分解决了 N - 烷基化的问题，但又出现了其他合成挑战，最终只有部分连接子（如连接子 20 - 24）成功合成。
7. 合成连接子的体外稳定性研究：对成功合成的六种连接子（3，20 - 24）进行体外稳定性研究，结果显示连接子 3 在生理条件下（pH 7.4）稳定性良好，在 pH 5.5 和 4.5 时水解迅速，符合预期；连接子 21 在各种酸性条件下比连接子 3 更稳定，但也具备在酸性增强时快速水解的能力；连接子 20 在所有测试 pH 条件下均快速水解，不适合药物递送；连接子 22 - 24 的稳定性各不相同，其中连接子 24 表现出极高的水解抗性，可作为阴性对照。总体而言，水解稳定性实验初步证明了利用酰腙水解实现双载荷释放的概念，连接子 3 和 21 是理想的先导化合物。

在研究结论和讨论部分，研究人员通过合成多种不同结构的连接子，深入探究了多功能化酰腙连接子框架的结构 - 稳定性关系（SSRs） 。这些连接子能够在 pH 4.5 - 7.4 的范围内实现快速裂解和双载荷释放。连接子 3 和 21 的良好表现为新型双释放概念提供了有力支持，它们可以在各种应用中实现两种载荷在预期作用位点的选择性递送和释放，避免在生理系统中过早释放，从而有望获得协同治疗效果。这一研究成果为细胞内药物递送和协同治疗领域提供了新的思路和方法，推动了生命科学和健康医学领域的发展，尤其是在肿瘤治疗等方面具有潜在的应用价值，有望为攻克多药耐药等难题带来新的希望。