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眼睑后层缺损修复困难，研究人员开展生物工程双层黏膜 - 软骨（BMC）移植物用于眼睑后层重建的研究。结果显示，BMC 移植物能恢复眼睑结构和功能。这为眼睑重建提供新方案，推进了功能性眼睑替代物的临床转化。
在眼科领域，眼睑的健康至关重要，它不仅保护眼球，还参与维持眼表的正常生理功能。然而，因创伤、烧伤、肿瘤等因素导致的眼睑后层缺损，一直是面部重建中的棘手难题。据统计，过去十年间，美国急诊科有超 730 万次眼科创伤就诊记录，其中眼睑损伤约占 20%，这一庞大的数据背后，是众多患者面临的眼部功能障碍和外貌缺陷，也带来了沉重的社会经济负担。
传统的眼睑后层重建方法，如使用自体移植物（耳软骨移植物、口腔黏膜移植物）和生物材料（脱细胞真皮基质、多孔高密度聚乙烯等），都存在诸多弊端。这些替代物要么结构和机械性能不匹配，要么会引发供体部位并发症、移植物吸收和黏膜挛缩等问题，难以完美复制原生眼睑的生物力学特性和黏蛋白分泌功能。在这种困境下，开发能够同时恢复眼睑机械支撑和上皮功能的生物工程替代品迫在眉睫。
上海交通大学医学院附属第九人民医院的研究人员勇敢地迎接这一挑战，开展了生物工程双层黏膜 - 软骨（BMC）移植物用于眼睑后层重建的研究。他们巧妙地将组织工程软骨（TEC）与口腔黏膜外植体共培养，成功制备出 BMC 移植物。研究结果令人振奋，这种 BMC 移植物展现出强大的功能。在结构方面，它拥有分层上皮，具备屏障完整性和产生 MUC1 的能力，同时软骨层的拉伸模量达到 1.68MPa，符合手术要求；在功能上，移植到兔眼睑后层缺损模型中，BMC 移植物在维持眼睑形态和眨眼功能上表现出色，优于未处理的对照组和 TEC 移植物。而且，BMC 重建的眼睑能快速形成连续的分层上皮，并逐渐发展为富含 MUC5AC+杯状细胞的上皮，有效恢复了分泌功能。这一研究成果发表在《Biomaterials》上，为眼睑重建领域带来了新的曙光。
研究人员在研究过程中运用了多种关键技术方法。首先是组织工程技术，通过特定的培养条件，将兔耳软骨细胞（rACs）接种到 I 型胶原（Col I）海绵支架上，构建 TEC 移植物，再与口腔黏膜外植体共培养获得 BMC 移植物。其次，采用了多种染色技术，如苏木精 - 伊红（H&E）染色、番红 O 染色、TUNEL 染色、免疫组织化学染色和免疫荧光染色等，用于观察组织的形态结构、细胞增殖和分化情况。此外，还运用了生物力学测试技术，使用 Dynamic Mechanical Analysis Q800 系统评估移植物的力学性能。实验选用新西兰白兔构建眼睑后层缺损模型，以此评估移植物的重建效果。
下面详细介绍研究结果：
- 优化口腔黏膜外植体在 TEC 移植物上的种植表面：研究发现，TEC 移植物致密的软骨表面会阻碍口腔黏膜外植体的上皮细胞生长，而疏松的 Col I 支架表面更有利于上皮细胞的扩展和增殖。在致密表面，上皮细胞向外扩展少，而在疏松表面和空支架上，上皮细胞扩展明显，空支架组上皮面积最大，且上皮层数最多。免疫染色结果显示，空支架组的上皮干细胞（p63+细胞）和增殖细胞（Ki67+细胞）密度最高，证实致密的 Col II+软骨表面会抑制上皮干细胞的激活。
- 优化口腔黏膜外植体的体外器官型培养基：为促进上皮干细胞的增殖和维持，研究人员在传统上皮细胞生长培养基（EpiCM）中添加 CHIR99021、Noggin 和 Forskolin，得到改良培养基 EpiCM+++。实验表明，在 EpiCM+++ 中培养的口腔黏膜外植体，上皮细胞的扩展面积更大，细胞层数更多，p63+细胞和 Ki67+细胞密度也更高，这表明改良培养基能有效增强口腔黏膜上皮细胞的扩展能力。
- 口腔黏膜外植体在 TEC 移植物疏松表面的整合：通过缩短 TEC 移植物的软骨形成培养时间，降低软骨层厚度，并使用 EpiCM+++ 培养基共培养，研究人员发现 10d - TEC 移植物与 EpiCM+++ 组合效果最佳。在该条件下，BMC 移植物的上皮扩展面积显著增大，形成了连续的分层上皮，且上皮干细胞的激活程度更高，同时 BMC 移植物的机械强度也能满足要求。
- 将 BMC 移植物放大到临床相关尺寸：研究人员成功将 BMC 移植物放大到 20×10×1mm 的临床相关尺寸。放大后的 BMC 移植物具有连续的分层上皮和致密的软骨层，上皮表达关键蛋白，如 CK4、p63、Ki67、ZO - 1 和 E - cadherin 等，表明其具有成熟的黏膜上皮表型和良好的屏障功能。此外，BMC 移植物的拉伸模量为 1.68MPa，与先前构建的 14d - TEC 移植物相当，具备用于兔眼睑重建的足够机械性能。
- 自体 BMC 移植物修复眼睑后层的短期结果：在兔眼睑后层缺损模型中，BMC 移植物在术后 2 周表现出色。与未处理的对照组和 TEC 移植物组相比，BMC 移植物重建的眼睑形态正常，有效抵抗了伤口收缩。组织学分析显示，BMC 移植物能形成连续的分层上皮，且上皮细胞的特征与原生结膜相似，证实其来源于口腔黏膜外植体。虽然三组在早期都有炎症反应，但主要是由急性手术创伤引起，而非免疫排斥。
- BMC 移植物修复眼睑后层的长期结果：术后 8 周，BMC 移植物重建的眼睑外观和功能持续良好。与对照组和 TEC 移植物组相比，BMC 移植物组的眼睑形态更接近原生眼睑，眨眼运动更自然，结膜表面光滑。组织学分析表明，此时炎症反应消失，BMC 移植物形成的上皮层细胞层数与原生结膜相当，且具有更高的 p63+细胞和 Ki67+细胞密度，显示出强大的再生潜力。
- BMC 处理的眼睑分泌功能的恢复：在分泌功能方面，术后 8 周，BMC 移植物重建的眼睑表现突出。与 TEC 移植物组相比，BMC 移植物组的 MUC5AC+杯状细胞密度显著更高，且 MUC1 表达明显增加，表明其成功恢复了分泌功能，更接近原生结膜。
综合研究结果和讨论部分，这项研究意义重大。研究人员成功开发出 BMC 复合移植物，通过共培养技术和培养基优化，使其具备结构和功能优势。在兔模型中的实验充分验证了 BMC 移植物在眼睑后层重建中的有效性，为临床应用提供了有力的理论和实验依据。然而，目前研究仍存在一些局限性，如仅在兔模型中进行验证，黏液分泌的生化复杂性尚未完全恢复，移植物制备的可扩展性和成本效益有待提高，黏膜和软骨层的整合还需优化等。未来，应进一步开展大动物研究和临床转化研究，通过先进技术实现个性化重建，确保移植物的安全性和标准化生产。总之，该研究为眼睑重建开辟了新方向，有望为众多眼睑缺损患者带来更好的治疗选择。
