长期体外扩增骨髓间充质干细胞的表型变化：深度剖析与临床启示

在细胞治疗中，骨髓间充质干细胞（BM - MSCs）体外扩增很重要，但长期扩增减低其治疗效用。研究人员评估其长期传代的表型变化，发现会降低成骨潜能、增加衰老等。这为理解 BM - MSCs 体外扩增变化提供依据，助力细胞治疗发展。

　　在生命科学和医学领域，细胞治疗成为攻克诸多疑难病症的新希望，其中骨髓间充质干细胞（Bone Marrow - Mesenchymal Stem Cells，BM - MSCs）备受瞩目。BM - MSCs 是一类存在于多种组织中的多能干细胞，像骨髓、脂肪组织、牙髓和脐带等都有它的身影 。不过，临床应用时，需要大量的 BM - MSCs，一般每千克体重约需两百万个细胞，这就使得体外扩增成为获取足够数量细胞的必经之路。

然而，随着研究的深入，问题逐渐浮现。长期体外培养和传代过程中，BM - MSCs 的 “个性” 发生了显著改变。它的自我更新能力不断减弱，就像一台逐渐老化的机器，生产效率越来越低；分化潜能也大打折扣，难以像最初那样精准地分化成各种所需细胞；细胞形态变得不规则，仿佛失去了原本整齐有序的模样；细胞表面标记物表达异常，如同细胞的 “身份标签” 出现混乱；分泌功能也出现偏差，分泌的各种因子不再正常发挥作用。这些变化严重影响了 BM - MSCs 在细胞治疗中的效果，使得临床应用面临巨大挑战。为了更好地利用 BM - MSCs 进行细胞治疗，深入了解这些表型变化及其背后的机制迫在眉睫。

来自国外的研究人员针对这一难题展开了深入研究。他们旨在全面评估长期体外培养对 BM - MSCs 的影响，探索其在形态、表型和基因表达等层面的变化规律。研究结果意义重大，为进一步优化 BM - MSCs 的体外培养条件、提升细胞治疗效果提供了关键依据，相关研究成果发表在《Biochimie》杂志上。

研究人员采用了多种关键技术方法。在细胞培养与传代方面，从 20 - 30 岁健康男性捐赠者获取 BM - MSCs，在特定条件下培养和传代，根据细胞生长状态分为 “非衰老” 和 “衰老” 两组。实验过程中，运用了集落形成单位 - 成纤维细胞（CFU - F）测定评估细胞的自我更新能力；通过衰老相关 β - 半乳糖苷酶（SA - β - gal）染色检测细胞衰老程度；利用流式细胞术分析细胞表面标记物表达和细胞形态；采用蛋白质免疫印迹法（Western blotting）测定相关蛋白表达；借助实时定量聚合酶链反应（RT - qPCR）和组织学染色评估细胞的分化潜能；通过检测吲哚胺 2,3 - 双加氧酶（IDO）活性和共培养实验评估免疫抑制能力 。

研究结果如下：

1. 自我更新与衰老相关变化：通过 CFU - F 测定发现，随着传代次数增加，BM - MSCs 形成集落的能力显著下降，非衰老细胞的集落形成能力明显强于衰老细胞。SA - β - gal 染色结果显示，衰老细胞中表达 SA - β - gal 的细胞比例远超非衰老细胞，表明衰老细胞数量大幅增加。同时，细胞形态也发生改变，多数细胞群体在达到复制性衰老时，特定散射强度范围内的细胞比例减少，不过有一组细胞（BM - MSC 310277）较为特殊，其细胞大小和颗粒度变化不明显，但集落形成能力和衰老细胞数量仍有改变。
2. 分泌谱改变：对 96 种生长因子、趋化因子和细胞因子进行评估，发现 66 种在可检测范围内。长期传代后，上皮来源的中性粒细胞激活肽 78（ENA - 78）、粒细胞趋化蛋白 2（GCP - 2）等 9 种蛋白表达显著下调，而单核细胞趋化蛋白 - 1（MCP - 1）和基质细胞衍生因子 - 1α（SDF - 1）两种蛋白表达显著上调。这些变化影响了 BM - MSCs 的再生和免疫调节潜能。
3. 表面免疫表型变化：利用流式细胞术量化细胞表面标记物表达，发现 CD73、CD90 和 CD105 等阳性标记物细胞数量大多保持不变或略有下降，其中 CD73 和 CD90 在衰老细胞中的表达显著降低。CD45、CD34 等阴性标记物表达基本稳定。其他标记物如 CD271、CD200、CD140a 和 CD49a 等表达呈现不同变化趋势，CD140b 表达则在所有组中均下降，这可能影响细胞的功能。
4. 衰老相关蛋白表达变化：通过蛋白质免疫印迹法评估 7 种与衰老相关分泌表型（SASP）相关的蛋白表达，发现衰老细胞中 p53 表达升高，p14ARF、MMP - 3 和 p21^Waf1/Cip1在非衰老细胞中表达更高，p16^INK4a和 IL - 6 在部分衰老细胞组中表达增加。这些蛋白表达变化反映了细胞衰老过程中的分子调控变化。
5. 分化潜能改变：经组织学染色和 RT - qPCR 检测，长期体外培养的 BM - MSCs 成骨分化能力下降，表现为茜素红染色显示钙沉积减少，成骨相关基因如 ALP、COL1A1 等表达下降。在脂肪分化方面，部分供体来源的细胞分化能力下降，部分保持不变，基因表达分析显示，脂肪分化关键基因 PPARγ、CEBPα 等表达降低。
6. 免疫抑制能力变化：评估 BM - MSCs 对 CD4⁺淋巴细胞的抑制能力和 IDO 分泌，发现长期传代后，其免疫抑制能力没有明显变化，不过不同供体来源的细胞表现有所差异，部分细胞抑制能力增强，部分减弱，且多数细胞组 IDO 分泌无显著变化，仅 BM - MSC 257 在高传代时 IDO 分泌增加。

研究结论和讨论部分指出，本研究全面揭示了长期体外培养对 BM - MSCs 的影响，发现其在形态、表型和基因表达等方面存在显著变化，且这些变化在不同细胞群体中具有异质性。衰老的 BM - MSCs 由于增殖和分化潜能降低、分泌表型改变，可能不太适合用于再生治疗。虽然在免疫调节活性方面研究结果与部分文献不一致，但总体上为深入理解 BM - MSCs 在体外扩增过程中的变化提供了重要信息，有助于优化细胞治疗策略，推动 BM - MSCs 在临床应用中的发展，对生命科学和健康医学领域的细胞治疗研究具有重要的参考价值 。