线粒体蛋白 OPA1：调控效应 CD8 T 细胞扩张的关键分子

本文聚焦线粒体蛋白视神经萎缩 1（OPA1）在 CD8 T 细胞中的作用。研究发现，OPA1 对效应 CD8 T 细胞的增殖、存活至关重要，其缺失会影响细胞周期、代谢等过程。这一成果为深入理解免疫反应机制及相关疾病治疗提供了新方向。

　　

研究背景

CD8 T 细胞在免疫反应中能快速增殖和克隆扩张，这一过程对能量和物质的需求巨大。不同的 T 细胞亚群（如初始、效应、记忆 T 细胞）代谢方式不同，效应 T 细胞主要依赖有氧糖酵解，而记忆 T 细胞则更多依靠线粒体代谢。

线粒体蛋白视神经萎缩 1（OPA1）在维持线粒体结构和功能方面意义重大，它参与线粒体嵴形成、Ca²⁺稳态调节、电子传递链（ETC）超复合物组装以及线粒体膜融合等过程。此前有研究表明，T 细胞中 OPA1 的缺失对记忆 T 细胞的形成和存活有显著影响，但对效应 T 细胞的影响尚不明确。

在研究 CD8 T 细胞免疫反应机制时，常用感染模型（如痘苗病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、单核细胞增生李斯特菌感染等），同时也有研究使用联合佐剂来诱导细胞免疫。本研究旨在探究 OPA1 在 CD8 T 细胞免疫反应中的作用，尤其是在效应 CD8 T 细胞中的功能。

实验方法

1. 小鼠模型构建：将 Opa1^fl/fl小鼠与 OT1 T 细胞受体转基因小鼠（表达 Cre 重组酶）杂交，获得 OT1 × Opa1^fl/fl Cre⁺（Opa1^?/? OT1）小鼠，使 Opa1 基因在 T 细胞中特异性缺失。同时构建 Mfn1^fl/fl、Mfn2^fl/fl及双敲除（Mfn dKO）小鼠模型，并与 OT1 和 dLck-Cre 背景杂交用于实验。
2. 细胞转移与免疫刺激：将野生型（WT）和 Opa1^?/?的 OT1 细胞，或 WT 与 Mfn 相关基因敲除的 OT1 细胞，共同转移到受体小鼠体内，随后对小鼠进行疫苗接种（如联合佐剂平台，包含聚肌胞苷酸（poly (I:C)）、抗 CD40 抗体和卵清蛋白（Ova））或感染（如表达 OT1 SIINFEKL 表位的痘苗病毒（VV.siin）、表达 Ova 的单核细胞增生李斯特菌（L. monocytogenes.Ova.vir 或 L. monocytogenes.Ova.ActA））处理。
3. 检测方法
   • 流式细胞术：用于分析细胞的频率、比例、表型（如 KLRG1、CD127、CD98 等分子的表达）、细胞内细胞因子（如 TNFα、IFNγ）、颗粒酶 B 表达、细胞脱颗粒（如 CD107a）以及细胞周期（通过 EdU 和 DRAQ7 染色）等情况。
   • 蛋白质印迹（Western blot）：检测 OPA1 蛋白的表达水平以及相关蛋白的变化。
   • 透射电子显微镜：观察线粒体的形态结构。
   • 单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）：对 naive 和激活后的 WT 和 Opa1^?/? CD8 T 细胞进行测序，分析细胞的转录特征和基因表达程序。
   • 代谢组学分析：通过稳态代谢组学和同位素示踪技术，研究细胞内代谢物的变化，包括氨基酸、酰基肉碱、三羧酸循环（TCA）中间产物等，以了解细胞的代谢状态。
   
   

实验结果

1. OPA1 缺失对 CD8 T 细胞免疫反应的影响
   • OPA1 缺失显著损害了初级和次级 CD8 T 细胞对疫苗接种或感染的反应。无论是疫苗诱导的 T（T_vac）细胞还是感染诱导的 T（T_inf）细胞，Opa1^?/?细胞的数量均明显减少，且功能受损，如细胞因子产生、颗粒酶 B 表达和脱颗粒能力下降。
   • 在效应 T 细胞中，Opa1^?/?对短寿命效应细胞（SLECs，KLRG1⁺ CD127^?）的影响比对记忆前体效应细胞（MPECs，KLRG1^? CD127⁺）更为显著，导致 SLECs 数量大幅减少。
   • OPA1 缺失也影响了记忆 T 细胞的形成和维持，使记忆 T 细胞池在初次挑战后随时间下降更明显，且再次挑战时回忆反应受损。
   
   
2. OPA1 缺失对 CD8 T 细胞增殖动力学的影响
   • Opa1^?/? CD8 T 细胞在免疫反应中的峰值出现延迟，在感染或接种疫苗后第 9 天才达到峰值，而 WT 细胞在第 7 天达到峰值。尽管 Opa1^?/?细胞在后期仍在尝试增殖，但最终细胞数量和频率仍显著低于 WT 细胞。
   • 通过 5 - 乙炔基 - 2'- 脱氧尿苷（EdU）标记实验发现，Opa1^?/?细胞在细胞周期 S 期的进入和进展存在缺陷，表现为 EdU 掺入减少、DNA 复制延迟以及细胞体积减小。
   
   
3. 增殖负担与 OPA1 缺失的关系：增加 T 细胞的增殖负担（如通过降低初始细胞频率或在淋巴细胞减少诱导的增殖（LIP）模型中），Opa1^?/? T 细胞的增殖缺陷更加明显。在 LIP 模型中，Opa1^?/? T 细胞的分裂次数明显少于 WT 细胞，且增殖细胞的比例也较低。
4. OPA1 与细胞生长、细胞周期和存活的关系
   • 在免疫反应早期，Opa1^?/? T 细胞进入细胞周期 S 期的比例显著低于 WT 细胞，且在 S 期的 DNA 合成和细胞生长也受到抑制，导致细胞分裂延迟。
   • Opa1^?/?细胞的存活率明显低于 WT 细胞，在抗原刺激或 LIP 过程中，细胞死亡增加，这与细胞内细胞色素 c 释放增加导致的凋亡有关。
   
   
5. scRNA - seq 分析结果
   • 通过 scRNA - seq 分析，发现 Opa1^?/? CD8 T 细胞存在独特的转录特征。在激活的细胞中，有一个转录簇（cluster 3）仅由 Opa1^?/?细胞组成，该簇细胞的 Myc 基因特征得分较高，表明 Myc 转录活性增强。
   • 利用共识非负矩阵分解（cNMF）分析，鉴定出五个基因表达程序（GEPs）。其中 GEP5 主要由 Opa1^?/?细胞表达，与 GEP3 相比，GEP5 在氧化还原和炎症相关基因集上有更高的归一化富集分数（NES），而在细胞定向相关基因集上的 NES 较低，同时在多个代谢途径相关基因集上也存在差异，表明 Opa1^?/?细胞的代谢途径发生了改变。
   
   
6. OPA1 的融合与非融合功能对效应 CD8 T 细胞扩张的影响
   • 研究发现，线粒体融合蛋白 MFN1 和 MFN2 缺失对效应 CD8 T 细胞反应的影响与 OPA1 缺失不同。虽然 MFN1/2 缺失也会导致 T 细胞数量减少，但对 SLECs 和 MPECs 的影响相对平衡，且其他效应细胞功能及记忆 T 细胞生成和二次反应的变化与 OPA1 缺失不一致。
   • 这表明 OPA1 在效应 CD8 T 细胞扩张中的作用不仅涉及线粒体融合，还包括其他非融合功能，其对线粒体呼吸和代谢途径的调控更为关键。
   
   
7. Opa1^?/? T 细胞的代谢缺陷
   • 代谢组学分析显示，Opa1^?/? T 细胞存在多种代谢缺陷。与 WT 和 Mfn dKO 细胞相比，Opa1^?/?细胞中 14 种氨基酸严重缺乏，酰基肉碱升高而 L - 肉碱减少，表明脂肪酸氧化（FAO）受损。
   • 通过基于流式细胞术的单细胞能量代谢分析（SCENITH）发现，Opa1^?/? T 细胞的线粒体 ATP 生成失败，对糖酵解的依赖性增强。此外，Opa1^?/? T 细胞的氨基酸代谢、氧化还原平衡和氮代谢也发生了改变，如非氧化戊糖磷酸途径中间产物升高、TCA 循环中间产物变化、NAD⁺水平升高等。
   
   

研究结论

1. OPA1 对效应 CD8 T 细胞的增殖和存活至关重要，其缺失导致细胞周期进展和存活缺陷，进而影响免疫反应的强度和记忆 T 细胞的形成。这一发现纠正了以往认为 OPA1 主要影响记忆 T 细胞的观点，强调了其在效应 T 细胞中的关键作用。
2. OPA1 的功能不仅仅局限于线粒体融合，其缺失导致的效应 T 细胞增殖和存活缺陷与多种代谢途径的失调有关。OPA1 在维持线粒体呼吸、调节氨基酸代谢和氧化还原平衡等方面发挥着重要作用，这些功能对于效应 T 细胞在免疫反应中的正常功能至关重要。
3. 本研究结果为深入理解 CD8 T 细胞免疫反应的机制提供了新的视角，也为相关疾病（如免疫缺陷病、自身免疫性疾病等）的治疗提供了潜在的靶点和理论基础。未来的研究可以进一步探究 OPA1 在不同免疫环境下的具体作用机制，以及如何通过调节 OPA1 的功能来改善免疫反应。