肠道成纤维细胞中 MyD88 介导的信号通路：调控巨噬细胞抗菌防御与肠道微生态平衡的关键机制

本文聚焦炎症性肠病（IBD），发现肠道成纤维细胞中 MyD88 信号对维持肠道稳态意义重大。其缺失会削弱巨噬细胞抗菌防御，引发菌群失调和 DSS 诱导的结肠炎。研究揭示该信号通过调节 IL-6 等因子影响巨噬细胞功能，为 IBD 治疗提供新方向。

　　

引言

炎症性肠病（IBD）是一类多因素疾病，宿主对微生物群的异常免疫反应破坏肠道稳态，导致慢性胃肠道炎症。肠道菌群在免疫反应中起关键作用，其组成改变（菌群失调）与 IBD 易感性相关。黏膜巨噬细胞是肠道抗菌防御的关键参与者，但其抗菌防御功能的调节机制尚不清楚。成纤维细胞是肠道黏膜中的重要细胞，可调节免疫反应，但它们在调节巨噬细胞抗菌防御中的作用未知。MyD88 在成纤维细胞对肠道微环境的反应中起重要作用，然而，成纤维细胞中 MyD88 依赖的信号对巨噬细胞活性的调节作用尚未明确。

结果

1. 成纤维细胞中 MyD88 缺失加重急性 DSS 结肠炎并降低结肠黏膜防御反应：为研究成纤维细胞特异性 MyD88 介导的信号在肠道稳态和 IBD 相关炎症中的作用，使用成纤维细胞特异性 MyD88 条件性敲除（MyD88KO-Fib）小鼠进行急性 DSS 结肠炎实验。结果显示，MyD88KO-Fib 小鼠在 DSS 诱导的急性结肠炎中，体重减轻百分比增加，炎症加重，结肠黏膜中促炎介质基因表达增加。转录组分析表明，MyD88KO-Fib 小鼠结肠黏膜中参与先天免疫反应和髓细胞抗菌反应的基因表达下降，免疫细胞群体分析显示单核细胞 / 巨噬细胞富集分数增加，而活化巨噬细胞和活化成纤维细胞分数减少。这些数据表明，成纤维细胞限制的 MyD88 信号参与炎症反应和髓细胞功能调节，在 IBD 相关肠道炎症的起始中起作用。
2. 成纤维细胞中 MyD88 缺失导致肠道菌群失调：研究发现，MyD88KO-Fib 小鼠的盲肠和结肠内容物中 α - 多样性降低，菌群组成改变。在门水平上，Bacteroides 与 Verrucomicrobia 的比例增加，Verrucomicrobia 与 Proteobacteria 的比例降低；在属水平上，Bacteroides spp. 相对丰度增加，Akkermansia spp.、Roseburia spp. 等减少，同时大肠杆菌等兼性厌氧菌增加。这些结果表明，成纤维细胞限制的 MyD88 信号调节微生物组组成，其功能障碍导致肠道菌群失调，与 IBD 相关菌群失调特征相似。
3. 成纤维细胞中 MyD88 缺失导致结肠黏膜中不成熟和成熟巨噬细胞积累以及产精氨酸酶 1 巨噬细胞增加：对 MyD88KO-Fib 小鼠结肠黏膜髓细胞进行荧光激活细胞分选（FACS）分析，发现 CD45⁺CD11b⁺髓细胞群体增加，不成熟（P2）和成熟（P3）巨噬细胞群体显著增加，但单核细胞群体无变化。激活黏膜细胞后，MyD88KO-Fib 小鼠的巨噬细胞对脂多糖（LPS）的反应较弱，肿瘤坏死因子 α（TNF-α）产生减少。此外，MyD88KO-Fib 小鼠结肠黏膜中精氨酸酶 1⁺成熟巨噬细胞（P3）比例显著增加，精氨酸酶 1/iNOS 比值升高，这可能损害巨噬细胞的防御反应。
4. 成纤维细胞限制的 MyD88 介导的成熟巨噬细胞调节在体内独立于 T 和 B 细胞反应：通过将 MyD88KO-Fib 和 MyD88^fl/fl小鼠与 Rag1^KO小鼠杂交，研究发现 Rag1^KOMyD88KO-Fib 小鼠结肠黏膜转录组变化与野生型 Rag1 小鼠相似，包括先天免疫反应相关分子表达下降、髓细胞迁移和防御反应相关过程受抑制等。这表明成纤维细胞限制的 MyD88 依赖信号直接调节髓细胞功能，其破坏可能导致宿主防御缺陷，且该调节对成熟巨噬细胞的影响独立于 T 和 B 细胞反应。
5. 成纤维细胞中 MyD88 缺失导致巨噬细胞体外精氨酸酶 1 增加和 Camp 产生减少：体外共培养实验表明，与 MyD88^WT成纤维细胞共培养的骨髓来源巨噬细胞相比，与 MyD88^KO成纤维细胞共培养的巨噬细胞中精氨酸酶 1⁺细胞数量增加，抗菌肽 Camp 产生减少。条件培养基实验表明，MyD88 依赖的成纤维细胞分泌的可溶性因子参与调节巨噬细胞中精氨酸酶 1 和 Camp 的表达，影响巨噬细胞的抗菌功能。
6. 缺乏 MyD88 的原代小鼠结肠成纤维细胞导致参与髓细胞调节的可溶性因子转录发生显著变化：对 MyD88^KO和 MyD88^WT成纤维细胞进行转录组分析，发现 MyD88^KO成纤维细胞中细胞因子、趋化因子、黏附分子和细胞外基质蛋白等的产生显著减少。基因本体（GO）分析显示，这些基因参与微生物感知、髓细胞迁移激活和抗菌防御反应等过程。其中，IL-6 和 CCL2 是成纤维细胞中依赖 MyD88 表达和分泌的关键因子，表明肠道成纤维细胞调节巨噬细胞功能涉及 MyD88 依赖的可溶性介质产生。
7. 巨噬细胞的抗菌活性受成纤维细胞 MyD88 依赖的 IL-6 和 CCL2 产生的调节：实验表明，中和 IL-6 或 CCL2 会降低巨噬细胞中 Camp 的产生和抗菌活性，添加重组 IL-6 可增加 Camp 表达，但 CCL2 无此作用，且二者之间无协同效应。此外，MyD88KO Fib 小鼠结肠和盲肠内容物中大肠杆菌等革兰氏阴性菌增加，表明成纤维细胞通过 MyD88 依赖的可溶性因子，特别是 IL-6，正向调节巨噬细胞抗菌防御，其受损可能导致 IBD 相关菌群失调。

讨论

本研究揭示了成纤维细胞在肠道中的新免疫调节功能，即成纤维细胞通过 MyD88 信号支持巨噬细胞的抗菌防御反应，其破坏会导致 IBD 相关菌群失调。肠道菌群与先天免疫细胞的相互作用对肠道稳态至关重要，而炎症驱动的菌群失调机制尚不完全清楚。本研究中，MyD88KO-Fib 小鼠出现肠道菌群失调，与 IBD 患者的菌群变化相似。虽然菌群失调与 IBD 炎症的因果关系仍有争议，但本研究表明成纤维细胞 MyD88 信号缺陷促进肠杆菌过度生长并加重炎症。

成纤维细胞通过分泌 IL-6 和 CCL2 等可溶性因子调节巨噬细胞的抗菌活性，其中 IL-6 在调节 Camp 产生和细菌清除功能中起重要作用。先前研究表明，IL-6 可调节鱼类和哺乳动物免疫细胞中 CAMPs 的产生，本研究进一步证实了其在肠道中的作用。此外，虽然本研究未检测到成纤维细胞直接产生抗菌肽，但不排除肠道壁中某些间充质细胞具有此功能。同时，研究还发现成纤维细胞中 MyD88 信号影响 C3 补体的转录水平，表明宿主对肠道微生物组组成的控制机制复杂。

本研究存在一定局限性，未涵盖成纤维细胞和巨噬细胞亚群的异质性，且主要关注肠道黏膜稳态期间的宿主防御，对炎症期间的防御机制研究较少。此外，体外实验使用骨髓来源的巨噬细胞不能完全反映体内肠道黏膜的情况。未来需要进一步研究特定亚群的间质细胞和巨噬细胞在抗菌防御中的作用及其相互作用机制。

资源可用性

• 主要联系人：如有资源和试剂需求，请联系 Irina V. Pinchuk（[e-mail]）。
• 材料可用性：本研究未产生新的独特试剂。
• 数据和代码可用性：批量 RNA-seq 原始测序数据已存入 NCBI 的基因表达综合数据库（GEO），原始 16S rRNA 测序数据和批量 RNA-seq 数据可在序列读取档案（SRA）中获取，相关代码可在https://doi.org/10.5281/zenodo.14941608上获取，显微镜和 FACS 数据可根据要求从主要联系人处获得。

实验模型和研究参与者详细信息

1. 小鼠：实验使用的小鼠包括 MyD88^flox/flox、Rag1^?/?、Acta2-CreERT 和总 MyD88 敲除小鼠，均购自 Jackson Laboratory。成纤维细胞特异性 tamoxifen 诱导的条件性敲除小鼠 B6TgCol1α2-CreMyD88^flox/flox（MyD88KO-Fib）由 PinchukLab 先前生成。所有实验程序均经宾夕法尼亚州立大学机构动物护理和使用委员会批准。
2. 实验性结肠炎模型：在特定病原体 - free 条件下饲养小鼠，7 周龄雄性和雌性小鼠用于实验。通过腹腔注射 tamoxifen 诱导成纤维细胞（COL1A2）和 ACTA2 特异性 MyD88 敲除，随后用 2%（wt/vol）的 DSS 饮用水诱导结肠炎 7 天，之后恢复 3 天饮用水。

方法详细信息

1. 组织病理学分析：结肠组织切片经固定、石蜡包埋后，用苏木精和伊红（H&E）染色，根据隐窝 / 黏膜组织结构破坏、淋巴细胞浸润和黏液产生杯状细胞减少等标准评估炎症程度并计算炎症评分。
2. 原代小鼠成纤维细胞和髓细胞的分离与共培养：新鲜小鼠结肠成纤维细胞按改良方法分离，骨髓来源的单核细胞用 Monocyte Isolation Kit（BM）分离。成纤维细胞与单核细胞按不同比例共培养，在某些实验中，单核细胞培养物在最后 16 小时用不同剂量的 LPS 激活。
3. 条件培养基：成纤维细胞培养至 70% 汇合度后收集条件培养基，离心去除细胞碎片后储存于 - 80°C。
4. RNA 测序和定量 RT-PCR：RNA 提取和定量 RT-PCR 按先前描述的方法进行，以 β - 肌动蛋白（β-actin）为内参基因，使用特定的 PCR 引物进行检测。
5. 批量 RNA-seq 分析：在 Illumina 平台上进行批量 RNA-seq，对原始数据进行处理、比对和分析，使用 R 编程环境和相关软件包进行差异表达分析、预后分析和基因集富集分析。
6. 细菌基因组 DNA 提取、16S rRNA 基因测序和分析：从结肠和盲肠内容物中提取细菌 DNA，进行 16S rRNA 基因 V3 - V4 区域扩增测序，对原始序列进行质量控制和分析，计算 α 多样性和 β 多样性指标，分析差异分类群丰度。
7. 大肠杆菌在骨髓来源巨噬细胞中的摄取和存活：使用粘附侵袭性大肠杆菌 NC101 进行细菌感染实验，评估骨髓来源巨噬细胞对细菌的摄取和存活能力。
8. 骨髓来源巨噬细胞产生抗菌物质的检测：采用琼脂孔扩散法检测骨髓来源巨噬细胞培养上清液对大肠杆菌的抗菌活性。
9. 细胞因子和趋化因子产生分析：使用 MILLIPLEX Mouse Myokine Magnetic Bead Panel 分析成纤维细胞培养条件培养基中的细胞因子和趋化因子。
10. 肠黏膜细胞制备和流式细胞术：制备肠黏膜细胞悬液，进行细胞表面和细胞内染色，用流式细胞仪分析细胞群体。
11. 免疫荧光显微镜：对冷冻的小鼠结肠切片和共培养的巨噬细胞和成纤维细胞进行免疫荧光染色，用显微镜观察并分析数据。

量化和统计分析

除非另有说明，结果以至少三个独立实验的平均值 ± 标准误差表示，使用单因素方差分析（ANOVA）进行多重比较，使用 Student's t 检验分析两组之间的差异显著性，使用 R 或 GraphPad Prism 8.3.0 软件计算统计显著性。