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本文聚焦叶绿体蛋白酶，详细阐述其在蛋白质成熟、数量与质量控制、氨基酸回收等方面的作用。如 CLP、FtsH、Deg 等蛋白酶（系统）参与多种代谢调控。还探讨了研究现状与未来方向，为深入理解叶绿体生理提供参考。
引言
叶绿体源于古代蓝藻的内共生事件，在植物细胞中保留部分自主性和双膜结构。其含有数千种蛋白质，大多由核基因组编码。为维持最佳光合和代谢性能，叶绿体需精准调控蛋白质组，蛋白质的水解加工是关键调控机制。目前已鉴定出 20 多种不同的蛋白水解系统，其中研究较多的蛋白酶包括 CLP、FtsH、Lon 和 Deg 蛋白酶。本文将围绕叶绿体蛋白酶在蛋白质成熟、质量控制、数量控制以及蛋白质降解回收氨基酸方面的最新研究进展展开。
蛋白质成熟
叶绿体中超 90% 的约 3000 种蛋白质由细胞核编码，经胞质核糖体合成，多数以前体形式存在，其 N 端有可切割的转运肽（TP）。这些前体通过 TP 与外膜（TOC 复合物）和内膜（TIC 复合物）上的转运体相互作用进入叶绿体。叶绿体内部的蛋白水解在 TP 切割中起关键作用，TP 随后被特定肽酶（如信号肽肽酶，SPPs）逐步降解。修剪后的蛋白质在基质中折叠、组装，或转运至内膜（IEM）、类囊体等部位。
定位到类囊体膜的蛋白质还需进一步切除信号肽以实现正确定位，主要由类囊体加工肽酶（TPP）完成。近期研究发现，其他蛋白酶或叶绿体发育条件会显著影响类囊体定位蛋白的成熟。如拟南芥 var2（ftsh2）和 abc1k1 突变体在红光下会积累不完整的类囊体蛋白加工中间体，与叶绿体发育缺陷相关。遗传分析表明，CLP 和 PREP 蛋白酶系统在拟南芥叶绿体蛋白质组成熟过程中存在协同相互作用，prep1prep2clpt1clpt2 纯合四突变体体现了这些蛋白水解系统的功能互补，暗示其潜在的底物重叠。
调节性膜内蛋白水解（RIP）可在转录水平调控基因表达，通过蛋白水解切割激活膜结合转录调节因子，使其从膜上释放。膜内蛋白酶的四个超家族可介导膜内蛋白水解，其中 EGY2（S2P 家族蛋白酶）参与 pTAC10、pTAC16 和 FLN1 的成熟。EGY2 通过蛋白水解切割促进这些膜锚定转录因子的激活，使其从膜上释放，进而与质体编码的 RNA 聚合酶核心复合物相互作用，可能调控叶绿体基因表达。缺失 EGY2 蛋白酶会显著影响关键叶绿体编码的光系统 II（PSII）核心脱辅基蛋白的积累，PsbA（D1）水平显著增加，而 PsbC（CP43）和 PsbD（D2）水平明显下降，且这种蛋白丰度的变化发生在转录水平。此外，pTAC10、pTAC16 和 FLN1 在 egy2 突变体系的类囊体膜中积累，表明 EGY2 可能通过蛋白水解切割激活膜锚定转录因子。
蛋白质数量控制
叶绿体作为复杂的细胞器，一些重要蛋白质的含量需精确调节，否则会导致代谢失衡。早期研究表明，催化叶绿素 a 合成叶绿素 b 的关键酶 CAO，受 CLP 蛋白酶精确调控，避免其在叶绿体中过度积累，维持叶绿素 a/b 和外周捕光复合物（LHC）对光环境的适应。CLP 复合物还与质体伴侣协同调节四吡咯和类异戊二烯生物合成关键酶的含量和折叠，确保叶绿体生物合成途径中代谢通量的精确控制。
近期研究发现，CLP 蛋白酶参与叶绿体逆向信号调节，通过调控 GENOMES UNCOUPLED1（GUN1）的含量发挥作用。拟南芥 GUN1 蛋白仅在叶片发育初期可检测到，在叶绿体生物发生和逆向信号调节中起关键作用。在改变逆向信号的胁迫条件下，GUN1 降解减缓，保证植物体内有足够的 GUN1 蛋白。GUN1 的快速周转主要由 CLPC1 控制，表明其可被 CLP 蛋白酶降解。另外，两种叶绿体基质蛋白 DUF760-1 和 DUF760-2 的周转速率差异显著，DUF760-1 半衰期约 4 - 6 小时，DUF760-2 极不稳定，检测其存在需抑制 CLP 活性，暗示其亚小时级的周转动态，且这两种蛋白在 clpc1-1 和 clpr2-1 突变体中显著富集，表明它们可能是 CLP 系统的底物。CLP 蛋白酶还参与调节叶绿体 Fe-S 簇合成支架 SUFBC2D 复合物各亚基的周转速率，通过快速降解 SUFB，协调 SUFB 的转录水平，以适应叶片衰老和植物缺铁的变化。对 clp 突变体的蛋白质组分析显示，数十种蛋白质可能是 CLP 伴侣 - 蛋白酶系统的潜在底物，其是否为真正底物以及含量是否受该蛋白酶系统调节有待进一步研究。
FtsH 蛋白酶也可动态调节蛋白质丰度。例如，蓝藻 FtsH4 作为 FtsH2/3 复合物的非冗余成分，在波动光照条件下通过平衡 Hlip 的合成和降解微调 PSII 的生物发生，但其调节 Hlip 表达以响应高光胁迫的机制尚不清楚。另有研究证实，蓝藻 FtsH4 通过降解未组装状态的组装因子 Ycf4、Ycf37、IsiA 以及单个 PsaA 和 PsaB 亚基，参与 PSI 的组装。FtsH 蛋白酶自身的含量也受到严格控制，EngA 可直接结合 FtsH 的 ATP 酶结构域，调节其周转动力学。EngA 过表达通过这种相互作用稳定 FtsH，但却损害了 PSII 的修复机制，表现为 D1 降解片段的过度积累和活性氧生成增加，证明了受调节的 FtsH 蛋白酶对维持光合机构功能的重要性。
EVR3/EGY1/AMOS1 是一种与叶绿体膜相关的非 ATP 依赖金属蛋白酶。对 yellow variegated2（var2）突变体的增强子诱变筛选发现，破坏 EVR3/EGY1/AMOS1 会加剧叶片斑驳。在 evr3-1 突变体和 var2-5 evr3-1 双突变体中，PSII 的稳定性，尤其是 D1 蛋白的稳定性在高光条件下显著受损。Qi 等人证实 EVR3/EGY1/AMOS1 对稳定 PSII 核心蛋白和叶绿体发育至关重要，它与 FtsH2/VAR2 协同调节高光胁迫下 PSII 核心蛋白的周转。Chen 等人还发现，在三种不同的 egy1 功能缺失突变体中，与光系统 I 和 II 捕光复合物（LHCI 和 LHCII）相关的叶绿素 a/b 结合蛋白水平显著降低，这可能是 PSII 核心蛋白缺乏的次生效应。近期报道指出，egy1 突变体保卫母细胞、保卫细胞和叶肉细胞的质体中类囊体发育受损。直到最近才发现，EGY1 作为调节 Mg - 去螯合酶 1（SGR1）含量的蛋白酶，由支架蛋白 BALANCE OF CHLOROPHYLL METABOLISM1（BCM1）介导发挥作用，BCM1 - EGY1 模块通过对叶绿素生物合成和降解的翻译后调节维持叶绿素稳态。
大麦半胱氨酸蛋白酶 HvPAP14 可调节 LHCB、PSBO 和 Rubisco 大亚基的含量。在大麦中过表达 HvPAP14 表明该蛋白酶可切割上述三种蛋白。HvPAP14 主要位于叶绿体中，与类囊体膜密切相关，参与叶绿体蛋白的正常周转，可能在叶片衰老过程中降解大量蛋白质。抑制叶绿体半胱氨酸蛋白酶（如与 HvPAP14 最接近的直系同源物 AtCEP1）可延缓叶绿体蛋白（Rubisco 大亚基蛋白和 D1 蛋白）周转，上调光合基因表达，放大叶绿体逆向信号，增强植物的胁迫耐受性，表明半胱氨酸蛋白酶在叶绿体蛋白质数量控制中发挥作用。
蛋白质质量控制
叶绿体中的蛋白质可能会发生错误折叠，或受到严重的氧化应激等胁迫，导致其活性或功能丧失。若受损蛋白质未及时修复或清除，会导致叶绿体功能障碍。AAA + 蛋白酶系统（CLP、Deg、FtsH、Lon）利用 AAA + 结构域水解 ATP 驱动底物解折叠，将聚集、寡聚的蛋白质逐步线性化，进入蛋白水解腔进行降解。
在番茄果实成熟过程中，叶绿体向有色体分化时，CLP 蛋白酶会降解错误折叠和聚集的类胡萝卜素生物合成酶 1 - 脱氧木酮糖 5 - 磷酸合酶（DXS）和八氢番茄红素合酶（PSY），而 Orange（OR）和 CLPB3 伴侣蛋白通过减轻蛋白质折叠压力，促进这些酶的稳定性和积累，表明 CLP 蛋白酶与特定伴侣蛋白协同控制蛋白质质量。
FtsH 在叶绿体中的主要作用是在光合作用过程中维持蛋白质质量。光合作用初期需要光能，但光能也会不可避免地损伤 PSII，尤其是反应中心蛋白 D1。有趣的是，只有受损的 PSII 亚基会被 FtsH 复合物替换和降解，其余亚基似乎可被回收利用。在干旱、低温和高光胁迫下，叶绿体中的异源复合物 FtsH 会降解受损的 Lhcb1 和 Lhcb2 多肽，而 Lhcb3 的含量仅在高光处理后显著下降。D1 蛋白 N 端色氨酸残基的氧化被认为是 PSII 修复过程中的关键氧化步骤，由 FtsH 诱导的逐步降解所调控。通过筛选 ftsh 突变体的抑制子或增强子，发现了参与 FtsH 调节蛋白质质量控制的新蛋白。pga4 突变体的叶绿体发育缺陷，PGA4 编码叶绿体信号识别颗粒 54kDa（cpSRP54）蛋白，cpSRP54 与类囊体 FtsH 在维持类囊体膜蛋白质质量控制（PQC）中具有协同作用，为监测 cpSRP54 依赖的蛋白质转运和 FtsH 依赖的蛋白质降解提供了可追踪的底物和产物。
Deg 蛋白在叶绿体蛋白质质量调节中也起着关键作用。Deg 和 FtsH 蛋白酶在光损伤 D1 的降解中发挥重要作用，这是一个多步骤过程，涉及多种蛋白酶。在光抑制条件下，Deg 切割协助 FtsH 逐步降解 D1。Deg1 蛋白酶负责切割 D1 暴露在腔中的环，近期研究表明 Deg5/Deg8 蛋白水解复合物也参与该蛋白水解途径。Deg1 和 Deg5/Deg8 在光抑制过程中独立降解光合蛋白，结构研究表明 D1 暴露在腔中的区域能够到达 Deg1 的内部蛋白水解位点。Deg1 蛋白酶组装成同六聚体，活性更强、含量更丰富，对 PSII 修复和植物整体生长贡献更大。Deg1 还参与其他降解过程，包括切割拟南芥中的 LHCII 天线蛋白 CP29 和 CP26、PSII 相关的 PsbS（CP22）蛋白，以及在热应激下切割 PSII 外在亚基 PsbO 和可溶性电子载体质体蓝素。Deg5 和 Deg8 形成的六聚体在光氧化损伤 D1 的 CD 环初级切割中起作用。利用番茄植株研究发现，叶绿体腔中的 SlDeg5 和 SlDeg8 蛋白酶对 PSII 修复和果实成熟过程中叶绿体向有色体的转变并非必需。有趣的是，基质蛋白酶 Deg7 对 PSII 修复也至关重要，它在光损伤的 D1、D2、CP47 和 CP43 的初级切割中发挥作用。另一种位于类囊体基质侧的丝氨酸蛋白酶 Deg2，介导 PSII 捕光蛋白 Lhcb6 的应激响应性降解，遗传分析表明其通过调节短期胁迫，对维持叶绿体稳态和植物发育至关重要。Deg 介导切割产生的蛋白水解片段，随后通过 FtsH 蛋白酶复合物进行 ATP 依赖的加工，完成这一协同的蛋白水解级联反应。
蛋白质降解与氨基酸回收
在植物衰老过程中，叶绿体作为富含蛋白质的细胞器，会进行程序性的营养物质（如碳、氮和氨基酸）再动员，以支持生殖发育和胁迫适应。因此，衰老的特征是叶绿体蛋白质的大量损失，如 Rubisco、D1、D2、CP43、CP47、LHCs 等。这些过程涉及叶绿体蛋白质广泛的蛋白水解分解，生成可回收的氨基酸。拟南芥叶绿体利用由寡肽酶和氨肽酶组成的复杂蛋白水解级联反应，将多肽依次加工成短肽，最后切割成游离氨基酸，这种蛋白水解机制可能是一种保守的降解模式，在线粒体中也可能存在类似系统。
Kato 等人在烟草叶绿体的类核中鉴定出一种 DNA 结合蛋白酶 CND41，其参与衰老过程中 Rubisco 的降解和氮的转运。大麦 PAP14（HvPAP14），一种锚定在类囊体膜基质侧的半胱氨酸蛋白酶，参与 Rubisco 大亚基的切割，导致叶绿体中积累一种 44kDa 的切割产物。近期研究发现，拟南芥脯氨酰氨肽酶 PAP1 可释放 N 端脯氨酸，其有两种可变转录本，产生两种定位不同的蛋白质 PAP1.1 和 PAP1.2，PAP1.1 定位于叶绿体，PAP1.2 定位于细胞质。研究表明 PAP1 的活性可能参与脯氨酸稳态和积累，这对花粉发育和渗透胁迫耐受性至关重要，PAP1.1 和 PAP1.2 对脯氨酸积累均至关重要，而脯氨酸积累对植物的胁迫响应必不可少。
其他生理功能
除上述分子和生理功能外，叶绿体蛋白酶还参与其他生理功能，但分子机制尚不清楚。
近期研究预测，拟南芥叶绿体菱形样蛋白酶 10（RBL10）调节半乳糖脂生物合成。rbl10 突变体的单半乳糖基二酰甘油（MGDG）中酰基链分布发生改变，通过分析 RBL10 包含的大复合物，鉴定出与叶绿体脂质代谢相关的两种蛋白 —— 酰基载体蛋白 4（ACP4）和羧基转移酶相互作用蛋白 1（CTI1）与 RBL10 相互作用，但其在叶绿体脂质代谢中的作用机制仍需进一步研究。
质体蛋白酶 EVR3/EGY1/AMOS1 还通过 ABA 拮抗乙烯信号调节磷稳态。amos1 突变体表现出抗磷饥饿特性，AMOS1 在磷限制条件下平衡 ABA - 乙烯信号，通过反向调节这些植物激素调节细胞壁磷的释放，但其具体机制大多未知。
FtsH2 在冷胁迫下具有从类囊体膜中提取底物蛋白的功能，从而提高膜系统的流动性，增强植物的耐寒性，因此 var2（ftsh2）突变体对冷胁迫敏感。
EGY3 是叶绿体中的一种假蛋白酶，与 S2P 家族具有同源性，仅在植物细胞中发现，由于催化活性关键氨基酸基序的突变被预测为无活性。在高光和高温胁迫初期，EGY3 基因的表达和蛋白质丰度显著增加。在这种胁迫条件下，egy3 突变体与野生型植株在与 Rubisco 折叠、甘氨酸代谢和 PSI 相关的蛋白质积累方面存在差异，而 PSII 蛋白水平保持不变。此外，EGY3 可能稳定 Cu/Zn - SOD2（CSD2），调节 H2O2含量，并参与叶绿体到细胞核的逆向信号通路，但其分子作用仍不明确。
总结与展望
本文从蛋白质成熟、蛋白质数量控制、蛋白质质量控制以及蛋白质降解和氨基酸回收等方面对叶绿体蛋白酶进行了阐述。实际上，叶绿体蛋白酶对底物蛋白的调节往往不止涉及一个方面，如 FtsH 在参与 D1 质量控制的同时，也是降解 D1 并回收其氨基酸的第一步。不同类型的蛋白酶在功能上也存在协同或重叠。未来，还需进一步明确众多潜在底物与叶绿体蛋白酶的关系，深入探究蛋白酶参与的复杂调控机制，以及它们在植物应对各种环境胁迫中的精细调节作用，为全面理解叶绿体生理过程提供更深入的理论依据。
