马铃薯Kunitz-STI抑制剂M271与猪胰蛋白酶非经典抑制复合物的结构解析及其机制研究

本研究针对Kunitz-STI家族抑制剂的蛋白酶抑制机制多样性问题，通过X射线晶体学解析了马铃薯来源的M271与猪胰蛋白酶的新型非经典抑制复合物结构。研究发现M271通过β1-β2和β3-β4环区（而非传统β4-β5环）立体阻碍胰蛋白酶活性中心，其抑制常数Ki达6.6 nM，揭示了Kunitz-STI折叠的可塑性为多功能蛋白酶抑制剂设计提供了新思路。

　　

研究背景与意义
蛋白酶抑制剂在生物调控系统中扮演着"分子守门员"的角色，其中Kunitz-STI家族因其独特的β-三叶草折叠结构和多靶点抑制能力备受关注。尽管已有研究表明该家族成员可通过经典机制（依赖β4-β5环的P₁精氨酸与蛋白酶S₁位点结合）抑制胰蛋白酶，但3E8L等结构揭示的非经典抑制现象暗示该家族可能存在更复杂的调控网络。然而，现有研究多集中于大豆等植物来源的抑制剂，对马铃薯等作物中Kunitz-STI的结构与功能认知仍存在空白。

墨西哥国立自治大学的研究团队通过解析马铃薯Kunitz-STI成员M271与猪胰蛋白酶的复合物结构（PDB 9CSZ/9CT1），发现该抑制剂通过β1-β2和β3-β4双环协同作用实现非经典抑制，其6.6 nM的K_i值虽低于经典抑制的BbKI（12.9 nM），但显著高于突变体R54M（>500 nM）。这一发现发表于《Biochemical and Biophysical Research Communications》，为理解Kunitz-STI家族的结构可塑性和进化适应性提供了新视角。

关键技术方法
研究采用马铃薯基因组DNA克隆获得M271基因，通过X射线晶体学（APS 19-ID-D光束线）解析2.1 ?分辨率自由态和2.3 ?复合物结构。动力学分析使用荧光底物测定K_i值，结构比对采用RMSD评估（0.529 ? for 1AVX/1AVU）。

研究结果

1. M271表达与结构特征
   晶体显示典型Kunitz-STI折叠，但β9-β10、β6-β7等环区B_eq值表明其动态性高于其他区域。与API-A（3E8L）仅24-41%序列相似性，尤其β4-β5环缺乏碱性氨基酸。

2. 非经典抑制机制
   复合物结构中M271的β1-β2（含Tyr39）和β3-β4（含Leu64）环插入胰蛋白酶活性中心，形成立体阻碍。与经典抑制复合物（如6DWU）相比，催化三联体Ser195-His57-Asp102未被直接结合，但底物结合口袋被完全封闭。

3. 动力学与进化意义
   尽管β9-β10环存在精氨酸（潜在P₁位点），M271选择双环抑制策略。序列比对显示β1-β2/β3-β4环在Kunitz-STI家族中变异度最高（11个溶剂暴露环），暗示自然选择通过环区多样化扩展抑制谱。

结论与讨论
该研究首次揭示Kunitz-STI抑制剂通过非活性中心远端环区实现高效抑制的分子基础。与经典机制相比，这种"双环门闩"模式（β1-β2+β3-β4）不仅解释了R54M等突变体保留结合能力的原因，更表明Kunitz-STI折叠可通过不同环组合实现功能分化。这种结构可塑性为设计靶向S1家族蛋白酶的多功能抑制剂提供了新范式，特别是在农业害虫防治（利用植物源抑制剂）和血栓治疗（调控胰蛋白酶样蛋白酶）领域具有应用潜力。研究同时指出，当前计算预测方法需整合动态构象评估才能准确模拟此类复杂抑制相互作用。