革兰阴性菌Flavobacterium johnsoniae来源的GH64 β-1,3-葡聚糖酶的抗真菌活性及其多域功能解析

本研究针对真菌病原体防控需求，从革兰阴性菌Flavobacterium johnsoniae中克隆表达GH64家族β-1,3-葡聚糖酶Bgl64Fj，发现其能水解酵母细胞壁主要成分β-1,3-葡聚糖（如zymosan A和curdlan-gel），释放laminaripentaose（昆布五糖），并首次证实该酶独立抑制丝状真菌Trichoderma reesei的菌丝生长，且与GH19几丁质酶协同增强抑菌活性。通过构建GFP标记的多域蛋白和催化域缺失突变体，揭示RicinB（蓖麻毒素B样凝集素域）特异性结合β-葡聚糖，而催化域Bgl64FjCat单独即具备完全活性，为开发新型抗真菌制剂提供理论依据。

　　

真菌病害对农业和医疗健康构成持续威胁，而真菌细胞壁的主要成分β-1,3-葡聚糖成为抗真菌药物开发的潜在靶点。尽管GH16和GH17家族β-1,3-葡聚糖酶的抗真菌作用已被广泛研究，但GH64家族酶对丝状真菌的抑制效果仍是未解之谜。更令人困惑的是，许多微生物来源的β-1,3-葡聚糖酶具有复杂的多域结构，这些非催化域的功能及其对抗真菌活性的贡献尚不明确。

针对这些问题，日本研究团队从革兰阴性菌Flavobacterium johnsoniae NBRC 14942中克隆了GH64 β-1,3-葡聚糖酶Bgl64Fj。该酶具有独特的多域结构：N端信号肽、催化域、βγ-晶状体蛋白域（βγ-Cry）、蓖麻毒素B样凝集素域（RicinB）、碳水化合物结合模块家族6（CBM6）和C端域。研究人员通过原核表达系统在Escherichia coli中成功表达该酶，并构建了去除信号肽和C端域的截短体用于功能研究。

关键技术方法包括：1）基因克隆和原核表达；2）酶学性质分析（使用zymosan A、curdlan-gel等底物）；3）薄层色谱（TLC）鉴定水解产物；4）Trichoderma reesei菌丝生长抑制实验；5）GFP标记的域功能分析（βγ-Cry、RicinB和CBM6）；6）催化域单独缺失体（Bgl64FjCat）的活性比较。

Domain structure analysis of Bgl64Fj
通过生物信息学分析发现，Bgl64Fj是Flavobacterium属中首个被鉴定的GH64家族酶。酶学表征显示，该酶能有效水解酵母细胞壁来源的zymosan A、curdlan-gel和pachyman（茯苓多糖），主要产物为laminaripentaose（昆布五糖），表明其内切酶特性。

Antifungal activity assessment
突破性发现是Bgl64Fj单独即可抑制Trichoderma reesei的菌丝扩展，且与GH19几丁质酶存在协同效应。这是GH64家族酶调控丝状真菌生长的首例报道，拓展了该类酶的应用潜力。

Domain function elucidation
GFP融合实验揭示RicinB结构域特异性结合β-葡聚糖类底物，而令人意外的是，仅含催化域的Bgl64FjCat表现出与全长酶相当的活性和抑菌效果，说明催化域本身已具备完整功能，非催化域可能主要参与底物定位而非活性调控。

Conclusion
该研究不仅首次报道了GH64酶对丝状真菌的生长抑制活性，还阐明了多域酶中非催化域的功能分工。特别值得注意的是，催化域单独即展现完整活性的发现，为设计简化版抗真菌酶制剂提供了新思路。这些成果对开发新型生物防治剂具有重要意义，相关论文发表在《Biocatalysis and Agricultural Biotechnology》上。

研究同时提出若干待解问题：Bgl64Fj如何穿透真菌细胞壁发挥作用？其与GH19几丁质酶的协同机制是什么？这些问题的解答将推动抗真菌酶制剂的实际应用。作者团队特别指出，GH64酶在农业病原真菌防治和医药抗真菌感染领域具有双重应用前景。