C型凝集素(SpCTL)通过结合β-整合素调控拟穴青蟹(Scylla paramamosain)在副溶血弧菌感染中的抗菌肽合成机制

本研究针对甲壳类先天免疫中模式识别受体的功能机制问题，通过克隆和表征拟穴青蟹C型凝集素(SpCTL)，发现其重组蛋白(rSpCTL)对革兰氏阴/阳性菌及真菌具有钙离子依赖性凝集、抑菌和黏附活性。通过RNA干扰和质谱技术证实SpCTL通过结合血细胞膜表面Spβ-integrin调控抗菌肽(ALF1/3-5)表达，揭示了其在甲壳类抗副溶血弧菌(Vp)感染中的免疫调控通路，为无脊椎动物免疫防御机制研究提供新见解。

　　

在海洋甲壳类养殖业中，细菌性疾病如副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus, Vp)感染常造成重大经济损失。由于甲壳类缺乏适应性免疫系统，其防御完全依赖先天免疫机制，其中C型凝集素(C-type lectin, CTL)作为重要的模式识别受体(PRR)，能识别病原相关分子模式(PAMP)，但具体作用机制尚未完全阐明。拟穴青蟹(Scylla paramamosain)作为我国南方重要经济蟹种，其免疫防御研究对病害防控具有重要价值。

汕头大学的研究团队在《Aquaculture Reports》发表的研究中，首次从拟穴青蟹中克隆获得SpCTL全长cDNA，通过系统发育分析和结构预测发现其含有典型的碳水化合物识别域(CTLD)和QPD/WHD保守基序。研究采用原核表达获得重组蛋白rSpCTL，通过凝集实验、抑菌圈测定和Western blot验证其免疫功能；结合RNA干扰技术和LC-MS/MS质谱分析，解析了SpCTL与血细胞膜受体Spβ-integrin的互作关系；最后通过qPCR检测了相关抗菌肽(AMP)的表达调控。

3.1 SpCTL基因结构特征
通过RACE技术获得1145 bp的SpCTL全长序列，编码257个氨基酸，含19个氨基酸的信号肽和CTLD结构域。多重序列比对显示与中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)同源性达81%。三维结构预测显示其含有4个α螺旋和5个β折叠，通过两对保守二硫键(Cys⁸¹-Cys²¹⁴、Cys¹⁸⁷-Cys²⁰⁶)维持空间构象。

3.2 组织表达模式
qPCR结果显示，在副溶血弧菌(Vp)、脂多糖(LPS)、白斑综合征病毒(WSSV)和聚肌胞苷酸(Poly I:C)刺激下，SpCTL在血细胞和肝胰腺中呈现差异化表达：肝胰腺中先下调后上调，而血细胞中持续上调，表明其在血细胞中发挥快速免疫应答功能。

3.3 重组蛋白功能验证
原核表达的rSpCTL(57 kDa)在Ca²⁺存在下，对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、链球菌(Streptococcus b)、大肠杆菌(Escherichia coli)等7种微生物表现出浓度依赖性凝集活性，最低凝集浓度分别为128 μg/mL、4 μg/mL和8 μg/mL。抑菌实验显示其对弧菌(V. alginolyticus)和嗜水气单胞菌(A. hydrophila)抑制效果最强。

3.4 免疫调控机制
Far-Western blot和质谱鉴定发现rSpCTL特异性结合血细胞膜蛋白Spβ-integrin(约100 kDa)。RNA干扰实验显示，敲低SpCTL后，Spβ-integrin和抗菌肽(SpALF1/3-5)表达显著下调，而flotillin-2(SpFLT-2)表达先升后降，表明SpCTL通过Spβ-integrin而非FLT-2通路调控AMP合成。

该研究首次阐明SpCTL通过"病原识别-Spβ-integrin结合-AMP调控"的三级应答机制参与拟穴青蟹免疫防御。相较于前人研究，不仅证实了CTL的广谱抗菌功能，更揭示了其下游信号传导的具体靶点，为甲壳类病害防控提供了潜在分子靶标。值得注意的是，SpCTL对革兰氏阴性菌的强抑制作用，可能与其CTLD结构域中QPD基序特异性识别半乳糖有关，这为设计新型抗菌剂提供了结构基础。未来研究可进一步探索SpCTL-Spβ-integrin互作激活的具体信号通路（如JNK或MAPK途径），以及在不同发育阶段的免疫调控差异。