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为解决 RFRP3 在绵羊季节性繁殖中作用不明的问题，研究人员利用 CRISPR-Cas9 技术开展对 NPVF 基因编辑的研究，成功获得 6 只 NPVF 基因编辑绵羊，4 只可作 founders。这有助于明确 RFRP3 在季节性繁殖中的功能。
在大自然的奇妙规律中，许多动物都遵循着季节性繁殖的节奏。对于生活在温带和极地地区的动物而言，季节性繁殖是一种至关重要的适应策略。它们会根据日照时长的变化，巧妙地选择在最适宜的时间交配、生育，这样不仅能保证幼崽在环境条件优越时出生，有利于其存活和生长，还能在食物匮乏或环境恶劣时节省能量。在这个过程中，褪黑素（melatonin）扮演着关键角色，它就像是动物体内的 “生物钟” 信使。夜晚，松果体分泌的褪黑素会随着日照时长的改变而变化，进而影响一系列生理反应。在垂体结节部，褪黑素会引发一系列事件，最终导致中基底下丘脑局部三碘甲状腺原氨酸（T3）的产生增加，而 T3 又在大多数季节性功能（包括繁殖）的调控中发挥着重要作用。
然而，尽管科学家们已经了解到 T3 在季节性繁殖调控中的重要性，但 T3 究竟如何精确控制促性腺激素释放激素（GnRH）的输出，仍然是一个未解之谜。目前已知，下丘脑中分别产生 KISS1 和 RFRP3 的神经元群体似乎参与其中。KISS1 作为主要的 GnRH 分泌促进剂，其作用已经得到了充分的证实，但 RFRP3 在（季节性）繁殖控制中的功能却充满了谜团。过往的研究结果相互矛盾，暗示着其背后隐藏着复杂且难以捉摸的机制。在不同物种中，RFRP3 对繁殖的影响差异很大，在鱼类、仓鼠、小鼠等动物中的研究结果各不相同，在绵羊中的作用也不明确，这使得 RFRP3 在繁殖调控中的角色愈发扑朔迷离。
为了揭开 RFRP3 在绵羊季节性繁殖中作用的神秘面纱，法国国家农业、食品与环境研究院（INRAE）的研究人员展开了一项深入研究。他们运用 CRISPR-Cas9 基因编辑技术，对编码 RFRP3 的 NPVF 基因进行编辑，试图培育出 NPVF 基因功能缺失的绵羊模型，以此来明确 RFRP3 在季节性繁殖中的具体作用。研究成果发表在《animal》杂志上，为该领域的研究带来了新的曙光。
研究人员采用了一系列先进的技术方法来推进研究。首先，他们精心挑选了合适的实验动物，包括不同品种的供体母羊和受体母羊，这些母羊均来自 INRAE 的实验单位。其次，利用激素处理供体母羊，促使其产生单细胞胚胎，具体激素处理方案参考了前人研究并进行了优化。接着，对收集到的受精卵进行基因编辑，通过向受精卵中注射 sgRNA/Cas9 核糖核蛋白复合物实现对 NPVF 基因的编辑。此外，还对受体母羊进行激素处理，为胚胎移植创造适宜条件，最后将编辑后的胚胎移植到受体母羊体内。通过这些步骤，研究人员成功获得了基因编辑绵羊，并对新生羊羔进行基因分型，以确定 NPVF 基因的编辑情况。
在研究设计与实施方面，研究人员进行了多组实验，在两个连续的繁殖季节中开展了十次实验，每次实验都涉及 6 只供体母羊和 6 只受体母羊。实验中，他们采用了两种不同的策略对 NPVF 基因进行编辑。第一年，研究人员试图利用一对 sgRNA 删除 NPVF 基因的大部分外显子 2，从而阻断 RFRP1 和 RFRP3 的产生；第二年，为了避免第一年策略出现的问题，他们设计了单个 sgRNA，靶向位于外显子 1 起始密码子下游的序列，期望通过产生移码突变来破坏基因功能。
在实验结果方面，研究人员总共回收了 565 个单细胞阶段的胚胎或卵母细胞，经过基因编辑和培养后，获得了 270 个两细胞阶段的分裂胚胎，分裂率为 50%。将 196 个胚胎移植到 60 只受体母羊体内后，有 12 只母羊怀孕并成功产下 17 只羊羔。基因分型结果显示，17 只羊羔中有 6 只携带至少一个基因编辑（GE）等位基因。在这些基因编辑羊中，第一年实验没有获得预期的外显子 2 缺失的奠基动物，但发现了一些意外的突变情况；第二年实验获得了 3 只杂合的基因编辑动物，其中两只（雄性 #33497 和雌性 #33508）的编辑等位基因预计会产生提前终止密码子，可能导致 NPVF 基因功能丧失。
研究人员通过对实验结果的深入分析，得出了一系列重要结论。他们成功利用 CRISPR-Cas9 技术获得了 6 只 NPVF 基因编辑绵羊，其中 4 只可作为建立独立绵羊品系的奠基动物。这些奠基动物携带的突变等位基因中，至少有 4 个预计为无效等位基因，有望通过后续繁殖获得 NPVF 基因敲除（KO）的纯合动物。这为进一步研究 RFRP3 在绵羊季节性繁殖中的作用提供了有力的动物模型。
这项研究具有重要的意义。从基础科学角度来看，它为深入了解 RFRP3 在季节性繁殖中的作用机制提供了关键线索。通过建立 NPVF 基因编辑的绵羊模型，研究人员能够更直接地观察 RFRP3 缺失对绵羊繁殖周期的影响，有助于揭示季节性繁殖的分子调控网络。从应用角度来看，该研究成果为家畜繁殖技术的改进提供了理论基础，有望通过基因编辑技术优化绵羊的繁殖性能，提高畜牧业的生产效率。同时，研究过程中对实验技术和策略的探索，也为其他相关领域的研究提供了宝贵的经验。但研究也存在一定的局限性，如无法完全排除 sgRNA 的脱靶效应，且目前难以确定不同突变对 mRNA 和蛋白质 / 肽产生的具体影响，这些问题需要在后续研究中进一步探讨。不过，总体而言，该研究为解决 RFRP3 在季节性繁殖中作用这一长期存在的科学问题迈出了重要一步，为该领域的未来研究开辟了新的方向。
