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在生物学研究中，绿色荧光蛋白（GFP）广泛应用，但 SDS-PAGE 后其荧光检测受限。研究人员开展 GFP 凝胶内重折叠研究，发现用含 1%ɑCD 和 20% MeOH 的 Tris-Gly 缓冲液处理，可重折叠变性 GFP，该技术为 GFP 检测提供新方法。
在生命科学研究的舞台上，绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein，GFP）就像一个神奇的 “荧光标记笔”，广泛应用于多个领域。它能让科学家们轻松追踪融合蛋白在细胞内的 “行踪”，在活细胞中观察融合伙伴蛋白的亚细胞定位和动态变化；在色谱和电泳技术中，它也发挥着重要作用，成为快速灵敏的荧光标签，助力评估融合蛋白的表达水平和质量 。
然而，这个 “荧光标记笔” 在遇到 SDS-PAGE（Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis，十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳）时却遭遇了难题。在 SDS-PAGE 实验中，样本需要在加载前进行热变性处理，这一过程会使 GFP 的荧光消失，导致无法直接检测。目前常用的检测 GFP 融合蛋白的方法是 Western blotting（蛋白质免疫印迹），但这种方法不仅成本高、耗时长，还存在诸如蛋白质转移不均、增强化学发光检测动态范围有限等问题。为了解决这些困境，国外研究人员开启了一项探索之旅。
研究人员来自多个机构，他们围绕如何实现 SDS-PAGE 后 GFP 的凝胶内荧光检测这一关键问题展开研究。经过一系列实验，他们成功开发出一种优化的方法，能够在 SDS-PAGE 凝胶中重折叠完全变性的 GFP，这一成果发表在《Analytical Biochemistry》上。该方法为 GFP 标记蛋白的检测提供了一种快速、简便且经济的替代方案，具有重要的意义。
研究人员开展此项研究时，用到了多种关键技术方法。首先是蛋白质表达与收获技术，在大肠杆菌（E. coli）和哺乳动物细胞（如 HEK293 细胞）中表达不同的 GFP 及其融合蛋白，然后通过离心、超声破碎等方式收获蛋白质。其次是 SDS-PAGE 技术，用于分离蛋白质样品。还有凝胶内重折叠技术，通过特定的缓冲液处理凝胶，实现 GFP 的重折叠。另外，利用总蛋白染色（如 SYPRO Orange 染色）和 Western blotting 技术，分别对总蛋白和目标蛋白进行检测和分析。
优化 GFP 凝胶内重折叠方案
研究人员推测环糊精和有机溶剂可能有效去除 SDS，从而实现 GFP 的重折叠。以表达 sfGFP（superfolder GFP，超级折叠绿色荧光蛋白）的大肠杆菌裂解物为模型，测试不同有机溶剂和环糊精的作用。结果发现，异丙醇（iPrOH）和乙腈（MeCN）在协助重折叠方面表现较好，而甲醇（MeOH）和乙醇（EtOH）效果稍逊。环糊精（如ɑ - 环糊精（ɑCD）和 β - 环糊精（βCD））能显著增强 sfGFP 的重折叠，几乎实现荧光的定量恢复。综合考虑，最终确定 1%ɑCD 和 20% MeOH 的 Tris - Gly 缓冲液为优化的重折叠缓冲液，并确定 30 分钟为最佳孵育时间。
蛋白沉淀法变性的 sfGFP 的凝胶内重折叠
蛋白质沉淀是常用的实验技术，但三氯乙酸（TCA）沉淀等方法会使 GFP 变性，影响检测。研究人员测试了经 TCA、丙酮和氯仿 - 甲醇沉淀后的 sfGFP 能否在 SDS-PAGE 后重折叠并实现凝胶内荧光检测。结果表明，经过重折叠程序，所有沉淀样品都能观察到凝胶内荧光，包括 TCA 沉淀且在 98°C 复溶的样品，证明该重折叠方法对沉淀变性的 sfGFP 有效。
该方法在哺乳动物细胞表达的 GFP 融合蛋白中的应用
研究人员进一步测试该方法在人细胞系中表达的 GFP 融合蛋白上的实用性。以角鲨烯单加氧酶（squalene monooxygenase，SM）与不同 GFP 变体（turboGFP（tGFP）、EGFP 和 msfGFP）的融合蛋白为例，发现 tGFP 和 msfGFP 融合蛋白重折叠效果较好，而 EGFP 融合蛋白重折叠效率较低。对于 NPC1（Niemann - Pick type C1，尼曼 - 匹克 C1 型蛋白）膜蛋白片段与 tGFP 的融合蛋白，也成功实现了重折叠。但红色荧光蛋白 TagRFP 在优化条件下无法重折叠，可能与其发色团结构不稳定有关。
凝胶内重折叠方案与 Western blotting 的兼容性
研究发现，重折叠后的凝胶与 Western blotting 兼容。在对 SM - FLAG - GFPs 等融合蛋白的检测中，通过优化的转移缓冲液处理，能有效将蛋白质转移到 PVDF 膜上，并通过相应抗体检测到目标蛋白。虽然部分蛋白质转移时可能需要补充 SDS 的转移缓冲液，但总体证明该重折叠方案可与 Western blotting 联用。
研究人员成功开发出一种在 SDS-PAGE 凝胶中重折叠完全变性 GFP 的方法，通过优化的缓冲液处理，实现了凝胶内 GFP 融合蛋白的荧光检测。该方法与总蛋白染色和 Western blotting 兼容，为 GFP 标记蛋白的检测提供了新的选择。不过，该方法的重折叠效率受 GFP 变体和融合伙伴蛋白的影响，对于 EGFP 融合蛋白重折叠效率较低，且红色荧光蛋白 TagRFP 无法重折叠。未来还需进一步研究，明确适用于凝胶内重折叠的 GFP 变体及其他荧光蛋白的范围，以及影响重折叠效率的因素，推动该技术在生命科学研究中的更广泛应用。
