基于微珠固定化肽段的高灵敏度肽阵列技术及其在牛奶过敏原表位分析中的应用

针对传统肽阵列灵敏度不足、难以临床转化的问题，研究人员开发了基于微珠辅助两步固定化技术的肽阵列系统。通过将生物素化肽段先结合链霉亲和素微珠再光交联固定，显著提升αS1-酪蛋白肽段密度与可及性，实现电化学发光(ECL)检测。该技术成功可视化牛奶过敏(CMA)患者血清IgE表位图谱，为个体化过敏诊断提供新工具。

　　

牛奶过敏困扰着全球约2-3%的婴幼儿，传统诊断主要依赖过敏原提取物的IgE检测，但血清特异性IgE(sIgE)水平与临床症状严重程度常不匹配。更精确的组分解析诊断(CRD)虽能检测特定蛋白组分，仍无法解释为何相同sIgE水平患者会出现迥异的临床反应。近年研究发现，过敏原蛋白的线性表位(IgE epitope)识别模式可能隐藏着答案——就像每个人的免疫系统拥有独特的"分子指纹"。

现有肽微阵列技术虽能绘制这些"指纹"，却受限于直接固定法导致的肽段密度不足，必须依赖复杂荧光检测系统。来自国内的研究团队在《Analytical Biochemistry》发表的研究中，创新性地将微珠技术与光交联化学结合：首先通过链霉亲和素(sAV)-生物素系统将αS1-酪蛋白衍生肽段锚定在微珠表面，再通过双叠氮(bAZ)光交联剂将肽段-微珠复合物固定于芯片。这种"分子积木"式的组装策略使单位面积肽段负载量提升数十倍，首次实现临床适用性电化学发光(ECL)检测。

关键技术包括：1)设计覆盖αS1-酪蛋白关键表位的15肽(Kaz 3/Kaz 12等)；2)优化微珠-肽段复合物与光交联剂比例；3)建立基于碱性磷酸酶(ALP)-化学发光底物的ECL检测体系；4)分析20例CMA患者血清IgE结合谱。

【Direct immobilization vs. microbead-assisted two-step immobilization】直接固定α-酪蛋白仅产生微弱信号，而微珠固定组信号增强8-10倍(图1)。关键发现是微珠表面sAV提供的三维空间显著增加肽段可及性，且最适bAZ浓度为0.1%。

【Synthetic 15mer peptides】患者血清对Kaz 3(21-35位氨基酸)和Kaz 12(105-119位)表位呈现差异化识别：部分患者仅识别单个表位，而严重过敏者同时识别多个表位。这种"表位指纹"具有高度个体特异性。

【Discussion】该技术突破传统肽阵列两大局限：1)微珠三维结构克服平面固定导致的空间位阻；2)ECL检测灵敏度达临床实用水平。值得注意的是，不同患者即使对相同肽段反应强度相似，其表位组合模式也各不相同，这为解释临床症状异质性提供了分子基础。

研究意义在于：首次建立临床可推广的肽表位分析平台，其模块化设计可扩展至其他过敏原分析。发现个体化表位图谱或将成为预测过敏严重程度的新指标，为精准免疫治疗提供靶点。技术专利已获授权，有望推动肽阵列从研究工具向临床诊断的转化。