揭秘 RCC1L：守护线粒体 DNA 的关键 “卫士”

线粒体 DNA（mtDNA）对细胞能量供应意义重大，其维护机制却不明晰。研究人员聚焦 RCC1L 展开研究，发现它对维持线粒体拟核（mt - nucleoid）和 mtDNA 至关重要，且 RCC1LV1起关键作用。该成果为线粒体相关疾病研究提供新思路。

　　在细胞的微观世界里，线粒体如同一个个能量工厂，通过氧化磷酸化（OXPHOS）为细胞提供能量。而线粒体中携带的线粒体 DNA（mtDNA），虽然个头不大，却是这个能量工厂正常运转的关键 “密码”。人类 mtDNA 是一个 16.6kbp 的环状 DNA，它编码着 OXPHOS 系统的 13 个必需亚基、2 种 rRNA 和 22 种 tRNA¹ 。mtDNA 一旦出现维护缺陷，就会引发线粒体功能障碍，进而与人类疾病和衰老紧密相连。

在这个小小的线粒体中，mtDNA 并不是 “孤独” 存在的，它会与蛋白质一起包装成线粒体拟核（mt - nucleoid），这个结构高度有序，是 mtDNA 复制、分布和转录的功能单位。此前，研究人员已经发现 mt - nucleoid 在细胞周期中会发生数量变化，并且会大致均匀地分配到子细胞中，但对于 mt - nucleoid 维护的调控机制，仍然知之甚少。这就好比我们知道一辆车能跑起来离不开发动机里的关键零件，但却不清楚这些零件是如何被精准维护和调控的。

为了揭开这个神秘的面纱，来自日本东京大学、群马大学和东北大学的研究人员组成团队，开展了一项关于 RCC1L（染色体浓缩调节因子 1 样蛋白，regulator of chromosome condensation 1 - like protein）的研究。他们想知道 RCC1L 在 mt - nucleoid 和 mtDNA 的维护中究竟扮演着怎样的角色。最终，他们的研究成果发表在了《Scientific Reports》上，为我们带来了许多重要的发现。

研究人员主要运用了基因编辑、蛋白检测和分子生物学等关键技术。在基因编辑方面，利用 CRISPR/Cas9 技术构建 RCC1L 基因敲除（KO）细胞系；蛋白检测则通过 Western blot 分析来鉴定蛋白表达情况；分子生物学技术中，使用定量 PCR（qPCR）测定 mtDNA 和核 DNA（nDNA）的含量 ，借助共聚焦显微镜观察细胞和线粒体的形态以及 mt - nucleoid 的数量和分布。

RCC1L 是维持 mt - nucleoid 和 mtDNA 所必需的

研究人员首先对 HeLa 细胞中 RCC1L 的亚型表达进行探究，发现 RCC1L^V1的表达水平远高于 RCC1L^V2和 RCC1L^V3。随后，他们利用 CRISPR/Cas9 技术构建了 RCC1L 基因敲除的 HeLa 细胞系。在敲除细胞系中，研究人员发现，没有丙酮酸和尿苷的培养条件下，细胞无法生长，线粒体出现肿胀和碎片化，mt - nucleoid 数量和 mtDNA 含量显著下降，而且 mtDNA 的复制速率也低于野生型细胞。这一系列现象表明，RCC1L 在维持 mt - nucleoid 和 mtDNA 方面发挥着不可或缺的作用。

RCC1L^V1是维持 mt - nucleoid 和 mtDNA 的关键亚型

为了进一步确定每个 RCC1L 亚型的功能，研究人员将带有 FLAG 标签的各亚型分别转染到 RCC1L 基因敲除细胞中。结果显示，只有转染 RCC1L^V1的细胞能够恢复在无丙酮酸和尿苷培养基中的生长能力，其线粒体形态也恢复为管状网络结构，mt - nucleoid 数量和 mtDNA 含量也与野生型细胞相当。而转染 RCC1L^V2或 RCC1L^V3的细胞则无法恢复这些表型，这充分说明了 RCC1L^V1对于维持线粒体形态、mt - nucleoid 和 mtDNA 至关重要。

mt - nucleoid 减少伴随 mtDNA 消耗并非仅由线粒体翻译受损引起

RCC1L 缺失会影响线粒体核糖体组装，导致线粒体翻译功能障碍。为了探究 RCC1L 基因敲除细胞的表型是否由线粒体翻译功能障碍引起，研究人员用线粒体翻译抑制剂氯霉素（CAP）处理野生型细胞。结果发现，CAP 处理的细胞虽然线粒体出现肿胀和碎片化，mt - nucleoid 数量也减少了，但 mtDNA 含量并未改变，而且 mt - nucleoid 比野生型细胞更大。这表明 RCC1L 基因敲除细胞中 mt - nucleoid 和 mtDNA 的表型变化并非直接由线粒体翻译功能障碍导致。

RCC1L 基因敲除细胞中 MALSU1、TFAM 和 NME6 特异性减少

研究人员通过 Western blot 分析比较了 RCC1L 基因敲除细胞和 CAP 处理细胞中线粒体蛋白的变化。他们发现，在 RCC1L 基因敲除细胞中，MALSU1（参与线粒体核糖体大亚基成熟的蛋白）、TFAM（mtDNA 包装蛋白）和 NME6（参与线粒体嘧啶核苷酸代谢的蛋白）的表达降低，而在 CAP 处理细胞中这些蛋白表达未下降。这说明这些蛋白表达的减少与线粒体翻译功能障碍无关，其中 TFAM 和 NME6 可能是与 RCC1L^V1相关的维持 mtDNA 的潜在候选蛋白。

RCC1L 缺失后，mt - nucleoid 和 mtDNA 在特定时期迅速减少

研究人员利用 Cre - loxP 系统构建了条件性 RCC1L 基因敲除细胞系。在去除 RCC1L 后，他们观察到细胞线粒体在 12 - 15 天出现肿胀和碎片化，mt - nucleoid 数量和 mtDNA 含量在 12 天后开始显著下降，并且在 12 - 15 天期间，部分细胞还出现 mt - nucleoid 分布不均的现象。这表明 RCC1L 缺失会在特定时期导致线粒体碎片化和 mtDNA 减少几乎同时发生。

综合上述研究结果，研究人员确定了 RCC1L 在维持 mt - nucleoid 和 mtDNA 方面具有新的功能。此前研究中，RCC1L 敲低或脂肪细胞特异性敲除的小鼠未出现 mtDNA 减少，而本研究中完全敲除 RCC1L 的细胞系 mtDNA 水平显著下降，这说明 mtDNA 的消耗可能存在 RCC1L 水平阈值。而且 RCC1L^V1在其中起到关键作用，它对依赖 OXPHOS 的细胞生长、线粒体形态维持以及 mt - nucleoid 和 mtDNA 的稳定至关重要。

此外，研究还发现 MALSU1、TFAM 和 NME6 在 RCC1L 基因敲除细胞中的变化，为进一步探究 RCC1L 调控 mtDNA 的机制提供了方向。对 RCC1L 缺失后 mt - nucleoid 和 mtDNA 快速减少过程的研究，也有助于深入理解 RCC1L 的调控机制。这些研究成果为线粒体相关疾病的研究和治疗提供了新的理论基础，让我们朝着解开线粒体奥秘又迈进了重要的一步，有望为未来攻克线粒体功能障碍相关疾病带来新的希望和策略。