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在大脑发育过程中，维持基因组完整性至关重要，而 CITK 基因缺陷会导致 DNA 损伤积累等问题，引发 MCPH17 综合征。研究人员开展了 CITK 在同源重组（HR）及微管动力学中作用的研究。结果发现 CITK 通过 HDAC6 调控 BRCA1 定位，且靶向 HDAC6 可改善相关表型。这为 MCPH17 综合征治疗提供新方向。
大脑的正常发育离不开神经祖细胞的快速且持续增殖，在此过程中，维持基因组的完整性尤为关键。因为在神经祖细胞增殖和神经发生期间，与复制相关的 DNA 链断裂频繁发生。DNA 双链断裂（DSBs）的积累对神经祖细胞来说是极具毒性的，它可能引发染色体重排和突变，最终导致细胞死亡。
目前，修复 DSBs 主要通过同源重组（HR）和非同源末端连接（NHEJ）两种方式。其中，HR 在维持基因组保真度方面起着关键作用，它在细胞周期的 S 中期到 G2 期持续进行，相对缓慢但准确性高，以姐妹染色单体作为修复模板。然而，在大脑发育过程中，DNA 损伤修复机制一旦出现缺陷，就会引发严重的神经系统疾病，微头畸形（Microcephaly）便是其中之一。
原发性遗传性微头畸形（MCPH）大多由单基因隐性突变引起，至今已发现 30 个相关基因。Citron 激酶（CITK）基因就是其中之一，其突变会导致 MCPH17 综合征。CITK 缺失会使神经祖细胞出现微管不稳定、有丝分裂纺锤体定位缺陷、胞质分裂失败以及 DNA DSBs 积累等问题，最终引发依赖 TP53 的细胞衰老和凋亡。虽然已有研究表明 DNA 损伤积累与 HR 受损有关，但 CITK 在 HR 过程中的具体作用，以及微管动力学是否参与其中，仍有待进一步探索。
为了解开这些谜团，来自意大利都灵大学神经科学研究所（Neuroscience Institute Cavalieri Ottolenghi）、都灵大学 “Rita Levi Montalcini” 神经科学系等多个研究机构的研究人员展开了深入研究。他们的研究成果发表在《Cell Death and Disease》上，为揭示 MCPH17 综合征的发病机制和潜在治疗策略提供了重要线索。
研究人员在开展研究时，运用了多种关键技术方法。在细胞实验方面，他们通过 RNA 干扰（RNAi）技术下调相关基因的表达，以此研究基因功能；利用免疫沉淀和蛋白质免疫印迹（Western Blotting）技术，分析蛋白质之间的相互作用和表达水平；采用免疫荧光技术，观察细胞内蛋白质的定位和分布。在动物实验方面，他们构建了小鼠和斑马鱼模型，通过基因编辑和药物处理等手段，研究相关基因和蛋白在体内的功能。
研究结果如下：
- CITK 敲低损害 BRCA1 在 DSBs 的招募：研究人员利用 ONS76 髓母细胞瘤细胞进行实验，通过 RNAi 下调 CITK 表达，并使用博来霉素（Bleomycin）诱导 DSBs 积累。结果发现，早在转染后 24 小时，与对照组相比，CITK 缺失的细胞中 53BP1 标记的核焦点（一种可靠的 DSBs 增加标记）显著积累，而 BRCA1 焦点数量却减少，BRCA1 信号与 53BP1 焦点的共定位强度也明显降低。48 小时后，这些效应更加显著，同时 BRCA1 和 RAD51 蛋白及转录本水平也显著下调。这表明 CITK 对于 DNA 损伤诱导后 BRCA1 在 DSBs 的有效招募至关重要。
- CITK 缺失而非其催化活性损害 BRCA1 水平：研究人员利用携带临床相关移码（FS）或 CIT 激酶失活（KI）变异的人类多能干细胞分化的神经组织进行研究。结果发现，在哺乳动物中，CIT 的非催化结构域而非催化活性，在神经祖细胞发育过程中对 BRCA1 水平的调节起着关键作用。
- CITK 与 HDAC6 相互作用并调节其核水平：研究人员发现，CITK 敲低的样本中，α - 微管蛋白赖氨酸 - 40 乙酰化（ac - TUB，微管稳定性的关键指标）水平显著降低。通过对 CITK 相互作用组的分析，他们发现去泛素化酶 CYLD 和 HDAC6 与 CITK 存在相互作用。进一步实验证实，CITK 与 HDAC6 存在共免疫沉淀现象，且 CITK 能够调节 HDAC6 的核定位，CITK 缺失会导致 HDAC6 核水平显著增加。
- 靶向 HDAC6 恢复 BRCA1 水平并对抗 CITK 缺失细胞中的 DNA 损伤：研究人员通过 RNAi 降低 HDAC6 水平，发现 CITK - HDAC6 双敲低样本中 BRCA1 丰度恢复到对照水平，53BP1 阳性焦点数量也恢复正常。使用 HDAC6 特异性抑制剂 Tubastatin A（TubA）处理 CITK 缺失的 ONS - 76 细胞，同样能够显著增加 BRCA1 核积累，恢复 53BP1 焦点数量。此外，微管稳定剂紫杉醇（Paclitaxel）处理也能降低 HDAC6 核水平，防止 CITK 缺失导致的 DNA 损伤增加。
- HDAC6 抑制恢复 cita 功能缺失斑马鱼胚胎的微头畸形：斑马鱼有两个 CIT 同源物，其中 cita 与小鼠和人类的 CIT 基因在转录和蛋白质水平上具有较高的序列保守性。研究人员通过注射反义吗啉代寡核苷酸或 CRISPR - Cas9 sgRNAs，构建了 cita 功能缺失的斑马鱼模型，该模型出现了明显的头部尺寸减小的微头畸形表型。而注射全长小鼠 CITK（mCITK）表达质粒能够显著恢复头部尺寸。此外，抑制 Hdac6（通过 TubA 处理或 hdac6 敲低）能够有效改善 cita 功能缺失斑马鱼胚胎的微头畸形表型。
综上所述，研究人员的实验表明，CITK 在 HR 中起着不可或缺的作用，它通过与 HDAC6 相互作用，调节 BRCA1 在 DSBs 位点的招募，进而影响 DNA 损伤修复。这一发现揭示了 HR 与微管动力学之间的功能联系，为深入理解 MCPH17 综合征的发病机制提供了新的视角。同时，靶向 HDAC6 能够有效改善 CITK 缺失导致的 DNA 损伤和微头畸形表型，这为 MCPH17 综合征的治疗提供了潜在的新策略，有望为相关疾病的临床治疗带来新的突破。
