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自闭症谱系障碍（ASD）的神经生物学基础研究至关重要，目前对其大脑功能连接（FC）在不同年龄和大脑状态下的研究不足。研究人员对 Shank3b小鼠进行纵向评估，发现其皮质网络过度连接随年龄发展，且受大脑状态影响，麻醉可逆转该现象。这为 ASD 治疗提供潜在靶点。
在神秘的大脑世界里，自闭症谱系障碍（Autism Spectrum Disorders，ASD）一直是困扰科学界的难题。ASD 是一类神经发育障碍性疾病，患者存在社交沟通缺陷、重复刻板行为等症状。越来越多的证据表明，大脑网络功能障碍是 ASD 的核心神经生物学基础，因此，对大脑功能连接（Functional Connectivity，FC）的研究成为了解 ASD 相关大规模网络改变的关键。
然而，目前的研究存在诸多问题。一方面，尽管 ASD 是神经发育性疾病，但在小鼠模型中，对其大脑连接在发育过程中的研究却很少，尤其是从发育到成年阶段跟踪 FC 变化的纵向研究极为匮乏。另一方面，FC 受大脑状态影响，而现有的小鼠 FC 研究大多集中在麻醉状态下的成年小鼠，对于麻醉和年龄对 ASD 患者皮质功能网络的差异影响，几乎无人探究。
为了填补这些空白，来自意大利多个研究机构（包括意大利国家研究委员会神经科学研究所、欧洲非线性光谱实验室、佛罗伦萨大学等）的研究人员展开了一项深入研究。他们以 Shank3b小鼠为研究对象，该小鼠模型与人类 Phelan-McDermid 综合征（PMS）相关，Shank3 基因编码的蛋白是兴奋性突触的后突触支架蛋白，其表达减少会导致突触传递和可塑性受损。研究人员通过一系列实验，试图揭示 ASD 相关的大脑皮质连接变化规律，为治疗 ASD 寻找潜在靶点。最终，研究成果发表在《Translational Psychiatry》上。
在研究过程中，研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：
- 宽场钙成像技术：通过在小鼠出生后第 30 天（P30）经眶后注射携带 GCaMP7f 的病毒载体 AAV-PHP.eB，实现对兴奋性神经元活动的标记，利用宽场显微镜在不同大脑状态（清醒、浅麻醉、深麻醉）和发育阶段（P45、P60、P90）下监测皮质活动。
- 行为学测试：在小鼠出生后第 20 天（P20）进行旷场实验，评估小鼠的焦虑样行为和运动活动；在成像过程中，对小鼠的肢体运动进行量化分析。
- 电生理记录：对成年（P90）小鼠的大脑切片进行全细胞电生理记录，研究初级躯体感觉皮层（SSp-bfd）中第 V 层锥体神经元的基本电生理特性、内在兴奋性和自发兴奋性突触后电流（sEPSCs）。
下面来详细看看研究结果：
- 青少年 Shank3b+/?小鼠表现出焦虑和异常梳理行为：在 P20 时，通过旷场实验发现，Shank3b+/?小鼠与 Shank3b+/+小鼠相比，虽然总移动距离相似，但在旷场中心停留时间更短，这表明其存在焦虑样行为；同时，Shank3b+/?小鼠梳理行为的频率降低，但单次梳理持续时间延长，显示出重复行为中断困难的特定梳理功能障碍。
- AAV-PHP.eB 在出生后第 30 天注射可诱导皮层中长期稳定的转基因表达：在 P30 注射 AAV-PHP.eB-CaMKIIα-GCaMP7f 后，在 P45、P60 和 P90 检测发现，GCaMP7f 表达稳定。通过对 P90 小鼠脑切片的免疫组化分析，证实 CaMKIIα 启动子对兴奋性神经元具有特异性，该方法可有效实现对自闭症小鼠模型体内纵向中尺度 Ca2+成像。
- 青少年 Shank3b+/?小鼠清醒状态下桶状皮层和视觉皮层过度连接：对 P45 的 Shank3b+/?小鼠研究发现，清醒状态下，其桶状皮层（SSp-bfd）和视觉皮层（VISp）存在显著的过度连接，而在浅麻醉和深麻醉状态下，FC 与对照组小鼠相似，呈现整体低连接趋势。这表明大脑状态对 Shank3b+/?小鼠的 FC 影响显著，在比较突变小鼠和野生型小鼠的 FC 时，监测大脑状态至关重要。
- P60 时过度连接更加突出并扩展到运动区域：在 P60，Shank3b+/?小鼠清醒状态下，涉及 SSp-bfd 的过度连接网络增强，同时前运动皮层（MOp-a）出现功能障碍。与 P45 结果不同，P60 时浅麻醉状态下也出现过度连接，且影响整个皮质网络（除 retrosplenial cortices，RSP 外）。深麻醉时，FC 虽有广泛但轻微的降低，但无显著变化。这说明随着小鼠年龄增长，网络功能障碍逐渐加重。
- P90 时功能连接改变持续存在：在 P90，Shank3b+/?小鼠清醒和浅麻醉状态下，均存在广泛的过度连接，而深麻醉时呈现低连接趋势。这表明从 P45 到 P90，Shank3b+/?小鼠的网络改变持续存在且依赖于大脑状态，网络功能障碍不断发展。
- 网络改变在清醒状态下最强：比较不同大脑状态下基因型之间的平均全局 FC 发现，Shank3b+/+小鼠在三种大脑状态下全局 FC 随时间保持稳定；而 Shank3b+/?小鼠在清醒和浅麻醉状态下，全局 FC 从 P45 到 P90 显著增加，深麻醉时与 Shank3b+/+小鼠相似。这进一步证明清醒状态下 Shank3b+/?小鼠的皮质网络过度连接更明显，且连接不平衡的严重程度高度依赖于大脑状态。
- Shank3b+/?小鼠的 FC 变化在全局信号回归分析后仍然存在：对钙成像数据进行全局信号回归（Global Signal Regression，GSR）分析后发现，不同大脑状态和发育时间点出现了不同的 FC 改变网络。尽管部分差异在 GSR 处理后消失，但总体上，Shank3b+/?小鼠的 FC 改变随年龄增长更加明显，这表明 ASD 相关的连接障碍随年龄恶化，且不受预处理分析的影响。
- 成年 Shank3b+/?小鼠 SSp-bfd 对自发兴奋性输入的反应增强：对 P90 小鼠 SSp-bfd 神经元进行电生理研究发现，Shank3b+/?小鼠与 Shank3b+/+小鼠相比，在基本电生理特性和内在兴奋性方面无差异，但 sEPSC 的幅度升高，这表明 SSp-bfd 神经元对兴奋性输入的敏感性增强，为 Shank3b+/?小鼠皮质网络全局过度连接提供了潜在的突触机制。
综合研究结论和讨论部分，该研究意义重大。它首次全面地从发育到成年阶段，在不同大脑状态下对 Shank3b小鼠的大脑皮质功能连接进行纵向评估，发现了与自闭症相关的关键皮质功能障碍网络。该网络从青少年时期桶状皮层的过度连接开始，随着年龄增长逐渐扩展和强化，且这种改变在清醒状态下更为明显，麻醉可显著减轻。这不仅揭示了 ASD 相关皮质连接改变的复杂性和动态性，还为理解 ASD 的神经生物学机制提供了重要依据。同时，研究确定的皮质功能障碍网络为开发针对 PMS 和 ASD 的非侵入性转化治疗提供了潜在靶点，有助于未来开发更有效的治疗策略，改善患者的生活质量。此外，研究中关于大脑状态对 FC 影响的发现，也为后续相关研究提供了重要参考，强调了在研究 ASD 大脑网络时考虑大脑状态的必要性。
