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在哺乳动物细胞定向进化研究中，现有基因组多样化方式存在局限，无法满足需求。研究人员开展了关于 CRISPR 引导的易错 DNA 聚合酶（EvolvR）的研究，发现 EvolvR 可多样化基因组位点的所有核苷酸，这为哺乳动物细胞基因组进化研究开辟了新途径。
在生命科学研究领域，定向进化技术就像一把神奇的钥匙，能够解锁生物分子的各种潜在功能，为生物技术的发展带来无限可能。传统的定向进化方法，主要在体外对感兴趣的基因进行多样化处理，比如利用易错 PCR、DNA 改组或饱和诱变等技术，然后将这些基因导入细胞或病毒中进行筛选。然而，这种方法存在诸多局限性，每一轮测试的变异体数量受到宿主细胞转化数量的限制，而且多轮定向进化不仅劳动强度大，还限制了并行进化的基因数量和实际持续时间 。
为了突破这些瓶颈，研究人员开发了体内连续进化技术，通过招募易错聚合酶或碱基编辑器直接在宿主细胞内对目标基因进行多样化。不过，现有的针对哺乳动物细胞体内连续进化的靶向超突变技术并不完美。正交病毒聚合酶和复制酶虽然理论上可以使感兴趣基因的所有核苷酸多样化，但病毒感染和复制的方式限制了其应用场景，难以在转录标准化和临床相关表达强度下评估功能变异，还容易受到 “作弊变异体” 的干扰 。而 CRISPR 靶向的碱基脱氨酶，如 CRISPR-X、dCas9-AIDx、HACE 等，虽然能有效突变哺乳动物基因组位点，但只能实现转换突变（C 到 T、A 到 G、G 到 A、T 到 C），无法获取绝大多数错义突变 。
在这样的背景下，美国加利福尼亚大学伯克利分校（University of California, Berkeley）的研究人员展开了一项重要研究。他们致力于开发一种能够在哺乳动物细胞基因组位点多样化所有 4 种核苷酸的技术，以实现体内连续定向进化中更广泛的变异探索。研究结果表明，他们设计的 EvolvR 系统成功实现了在哺乳动物细胞基因组位点对所有 4 种核苷酸的多样化，还发现了 nickase 的错配耐受性对 EvolvR 突变窗口和替代偏好的影响机制，并通过引入 PAM 灵活的 nickase 提高了 EvolvR 的实用性。该研究成果发表在《Nature Communications》上，为哺乳动物细胞基因组进化研究带来了新的突破，具有重要的科学意义和应用价值 。
研究人员在研究过程中运用了多种关键技术方法。首先是细胞培养技术，使用了 HEK293T、A375 和 BFP HEK293 等细胞系，在特定的培养基中进行培养。其次是转染技术，通过 Mirus X2 等转染试剂将相关质粒导入细胞。然后是下一代测序技术，用于分析 EvolvR 在基因组位点产生的突变，包括对 BFP 位点和 MAP2K1 位点的测序分析。此外，还运用了荧光报告基因检测技术，通过检测 BFP 到 GFP 的突变频率来评估 EvolvR 的诱变效率 。
EvolvR 多样化哺乳动物基因组位点
研究人员设计了 EvolvR 的改良版本，将来自工程化 SpCas9 变体的 nickase 与大肠杆菌聚合酶 I 的变体融合，并在 HEK293 细胞中进行测试。通过荧光报告基因检测发现，EvolvR 能够提高特定核苷酸的突变率，且 Pol I 的 flap 内切酶结构域对其靶向诱变并非必需。进一步利用下一代测序技术分析发现，EvolvR 在 gRNA 间隔区及以外区域产生了较高的替代率，所有 4 种核苷酸都发生了多样化，且突变具有双向性 。
EvolvR-based 筛选鉴定出耐药 MAP2K1 外显子 6 变体
研究人员将 EvolvR 靶向 MAP2K1 基因，该基因的变异与多种癌症对 ERK 通路抑制剂的耐药性相关。通过对 A375 细胞进行转染和筛选，发现了 7 种富集的变体，其中 6 种是替代变体，且这些变体通过 EvolvR 产生的替代方式是现有体内多样化技术无法实现的。对部分变体进行功能验证，证实了它们具有更高的耐药活性，同时还发现了一个插入变体，展示了 EvolvR 产生功能性插入缺失变体的潜力 。
Nickase 错配耐受性决定 EvolvR 介导的 gRNA 靶区内替代的多样性
研究人员发现，虽然已知的赋予耐药性的 T 到 A 替代在筛选中存在，但并非以之前报道的 V211D 突变形式出现，而是与另一个 G 到 C 替代同时发生，形成 V211H 错义突变。这是由于 SpCas9 对靶区内的单碱基错配具有序列特异性耐受性，而 EvolvR 的突变窗口和替代偏好受错配耐受性的影响。通过使用截短的 gRNA，研究人员发现可以提高 EvolvR 的突变率和替代变体的多样性，同时降低插入缺失变体的频率 。
整合高活性和特异性的 PAM 灵活 nickase 使大多数重叠 gRNA 能一致地对靶核苷酸进行诱变
研究人员评估了多种工程化 Cas9 变体，发现 EvolvR 多样化特定核苷酸的能力在很大程度上取决于核酸酶特性和 gRNA 设计。为了补偿 gRNA 变异性，他们考虑使用 PAM 灵活的 nickase，如 eNme2.NR 和 SlugCas9。实验发现，SlugCas9 表现出较高的可靠性，使用其构建的 EvolvR 在多种 gRNA 作用下能有效产生 BFP 到 GFP 的替代。进一步研究发现，R 环形成的自由能变化与 EvolvR 的突变率相关，这为预测 gRNA 的有效性提供了重要依据 。
在讨论部分，研究人员总结了 EvolvR 作为单分子多样化工具在哺乳动物细胞基因组进化中的重要意义。它能够突变基因组位点的所有 4 种核苷酸，Nickase 保真度对其突变特性有重要影响。NNG-Slug-nCas9-PolI5MΔ 的应用拓宽了 EvolvR 的靶向范围，R 环形成的自由能变化可用于预测 EvolvR 的突变率。然而，EvolvR 目前的突变窗口受 gRNA 数量限制，未来需要进一步工程化 DNA 聚合酶来扩大突变窗口。总的来说，该研究为哺乳动物细胞基因组进化研究提供了新的工具和思路，有助于推动相关领域的发展，为生物医学研究和生物技术应用带来新的机遇 。
