编辑推荐：
DNA 双链断裂（DSBs）严重威胁基因组完整性，在同源重组（HR）缺陷细胞中，DNA 聚合酶 theta（Polθ）通过微同源介导的末端连接（MMEJ）修复 DSBs 至关重要。研究人员解析 Polθ 解旋酶（Polθ-hel）与 DNA 结合结构，揭示其在 MMEJ 中的关键作用，为 HRD 癌症治疗提供新方向。
在生命的微观世界里，DNA 就像一座精密的信息宝库，储存着生物体的遗传密码。然而，DNA 双链断裂（DSBs）这一 “破坏者” 却时刻威胁着基因组的完整性，它就像宝库中的裂缝，若不及时修复，可能引发基因组不稳定，甚至导致肿瘤的发生。
细胞修复 DSBs 主要有同源重组（HR）和非同源末端连接（NHEJ）两种方式。HR 能够精确修复断裂的 DNA 末端，就像一位精细的工匠，将破碎的部分完美拼接，维持基因组的稳定，BRCA1/2 等主要 HR 因子在其中发挥着关键的 “监督” 作用，是重要的肿瘤抑制蛋白。但在 HR 缺陷的细胞中，通常是由于 BRCA1/2 等基因发生突变，就如同工匠失去了工具，HR 这条修复途径难以正常工作。此时，微同源介导的末端连接（MMEJ）就成为了 “救星”，而 DNA 聚合酶 theta（Polθ）则在 MMEJ 中扮演着核心角色，它能够促进 DSBs 的修复。
Polθ 由多个结构域组成，其中 Polθ 解旋酶结构域（Polθ-hel）在 MMEJ 中发挥着重要作用，参与了 DNA 结合、微同源序列搜索和退火等关键步骤。然而，长期以来，Polθ-hel 如何与 3′- 单链 DNA（3′-ssDNA）结合，以及在 MMEJ 过程中如何促进微同源序列的搜索和退火，这些分子机制一直是个谜。就像隐藏在黑暗中的宝藏，等待着科学家去探索和发现。
为了揭开这些谜团，来自美国南加州大学（University of Southern California）、托马斯杰斐逊大学（Thomas Jefferson University）等机构的研究人员开展了深入研究。他们通过冷冻电镜（cryo-EM）技术，解析了 Polθ-hel 与不同 3′-ssDNA 突出端的 DNA 复合物的结构，从原子层面揭示了 Polθ-hel 在 DNA 结合、微同源搜索和退火过程中的分子机制。
研究人员的主要技术方法包括：首先利用蛋白质表达与纯化技术，获取高纯度的 Polθ-hel 蛋白；接着通过冷冻电镜技术，制备并观察 Polθ-hel 与 DNA 复合物的结构；同时运用 DNA 结合实验（如荧光各向异性和凝胶迁移实验）和荧光共振能量转移（FRET）实验，研究蛋白质与 DNA 的相互作用以及 MMEJ 活性；此外，还构建了突变体，通过突变分析来验证 Polθ-hel 二聚体状态的功能作用。
研究结果如下：
- Polθ-hel 与 DNA 结合的多种状态结构：研究人员重构了 Polθ-hel 与不同 3′-ssDNA 突出端的模型 MMEJ 底物复合物，通过荧光各向异性和凝胶迁移实验证实 DNA 底物能以相似亲和力结合到 Polθ-hel 上。冷冻电镜结果显示，Polθ-hel 与 DNA 结合的复合物存在多种状态，包括微同源退火状态（MH annealed state）和微同源搜索状态（MH search state）。在这些状态下，Polθ-hel 以二聚体形式存在，DNA 双链通过解旋酶通道开口进入，3′端从通道另一侧穿出，使单链 DNA 末端靠近。在微同源退火状态下，可见连接两个通道出口的低密度区域，代表退火的微同源 DNA；而在微同源搜索状态下，由于没有微同源序列，该区域密度较弱。此外，研究还发现 Polθ-hel 的寡聚状态在二聚体和四聚体之间平衡，DNA 结合促进四聚体解离为二聚体。
- Polθ-hel 的 D5 结构域是一个可移动结构域：D5 结构域在不同状态下表现出显著的结构可变性。在无 DNA 结合（apo form）和结合非水解 ATP 类似物（AMP-PNP）的状态下，D5 附着在解旋酶环表面；而在微同源搜索状态下，D5 从解旋酶环上脱离，变得不可见；在微同源退火状态下，D5 重新出现在二聚体界面附近的不同位置，且发生了结构重折叠。这种位置的改变和结构重折叠使得 D5 能够为 3′-ssDNA 的出口创造空间，促进微同源搜索，同时稳定二聚体结构，对 MMEJ 过程至关重要。
- Polθ-hel 通道对 DNA 的捕获：3′-ssDNA 穿过 Polθ-hel 环的整个中央通道，在通道内与 D1、D2 和 D4 三个结构域广泛相互作用。通道入口处，D2 通过与 DNA 磷酸骨架的相互作用以及多个氨基酸残基的辅助，捕获 DNA；通道内部，ssDNA 沿着 D4 中的棘轮螺旋延伸，特定氨基酸残基的相互作用促进了 DNA 的单向转运；通道出口处，多个精氨酸残基稳定通过狭窄区域的 DNA。整个通道的表面静电势显示，入口和出口处均带正电，有利于 DNA 的捕获。
- DNA 结合诱导二聚体构象变化：与无 DNA 结合的状态相比，DNA 结合后 Polθ-hel 二聚体发生显著的构象重排。两个原聚体之间的相对位置转变为 “开放” 形式，D2 结构域的移动最为明显。这种构象变化使二聚体整体结构变平，在二聚体裂隙中创造出更宽的空间，有利于微同源搜索和退火。同时，DNA 结合还导致 DNA 通道出口变宽，表明通道具有一定的灵活性。
- Polθ-hel 二聚体界面突变破坏二聚化和 MMEJ：研究人员构建了两个破坏二聚体界面的突变体，通过凝胶迁移实验、荧光各向异性实验和 FRET 实验证实，突变体主要以单体形式存在，DNA 结合能力降低，且无法促进 MMEJ。冷冻电镜分析进一步确认突变体仅以单体形式存在，这表明二聚体形式的 Polθ-hel 对于促进 3′ ssDNA 突出端的联会和微同源退火至关重要。
研究结论和讨论部分表明，该研究首次揭示了 Polθ-hel 在 MMEJ 修复 DSBs 过程中的关键作用机制。Polθ-hel 的动态构象变化，包括 D5 结构域的移动和二聚体的构象改变，确保了 MMEJ 过程中对 3′-ssDNA 突出端的精确识别和处理。这些发现不仅为理解 DNA 修复机制提供了重要的基础，还为开发针对 HRD 癌症的精准治疗策略提供了潜在的药物靶点。例如，基于对 Polθ-hel 与 DNA 相互作用机制的理解，可以设计特异性的小分子抑制剂，阻断 Polθ-hel 在 MMEJ 中的功能，从而选择性地杀死 HRD 癌细胞，为癌症治疗开辟新的道路。
这项研究成果发表在《Nature Communications》上，为生命科学和医学领域在 DNA 修复机制和癌症治疗研究方面提供了重要的参考，有望推动相关领域的进一步发展，为攻克 HRD 癌症带来新的希望。
