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抗生素耐药严重威胁全球健康，金属 β- 内酰胺酶（MBLs）使 β- 内酰胺类抗生素失效且尚无临床可用抑制剂。研究人员开发动态手性膦酸类抑制剂，其可抑制多种 MBLs、穿透细菌膜且对人细胞无毒，为解决耐药问题带来新策略。
在现代医学的抗菌战场上，抗生素曾是屡建奇功的 “常胜将军”，但如今却遭遇了严峻挑战 —— 抗生素耐药。这一问题如同一场无硝烟的 “战争”，正威胁着全球数百万人的生命。其中，由金属 β- 内酰胺酶（Metallo-β-lactamases，MBLs）介导的耐药机制格外棘手。MBLs 如同细菌的 “秘密武器”，能轻松拆解广泛应用且生产成本低廉的 β- 内酰胺类抗生素，使得这类抗生素在对抗耐药菌时常常 “束手无策”。更为严峻的是，目前市面上还没有临床可用的 MBLs 抑制剂，这使得医生在面对 β- 内酰胺耐药菌感染时，治疗手段极为有限，现有的替代药物往往伴有严重的毒副作用。
在这样的困境下，来自瑞典乌普萨拉大学（Uppsala University）、中国科学院上海药物研究所等多个研究机构的科研人员携手，开展了一项极具意义的研究。他们致力于开发一种新型的 MBLs 抑制剂，以应对抗生素耐药这一难题。经过不懈努力，研究人员取得了令人瞩目的成果。他们成功设计并合成出动态手性膦酸类抑制剂，这类抑制剂不仅合成方法简便，而且展现出了强大的抗菌能力。它们能够有效穿透细菌膜，抑制包括 NDM-1、VIM-2 和 GIM-1 等在内的多种金属 β- 内酰胺酶，同时对人体细胞无毒。这一成果为解决抗生素耐药问题带来了新的曙光，有望成为对抗耐药菌感染的有力 “武器”。相关研究成果发表在《Communications Chemistry》杂志上。
在这项研究中，研究人员运用了多种关键技术方法。通过酶活性测定实验（如测定半数抑制浓度IC50）来评估抑制剂对金属 β- 内酰胺酶的抑制活性；采用核磁共振（NMR）技术，在接近生理条件下从原子层面探究酶与抑制剂的相互作用；利用 X 射线衍射技术解析抑制剂与酶的复合物结构，明确其结合模式；还通过计算对接和分子动力学模拟，对抑制剂与酶的结合进行理论预测和动态分析 。
立体动态抑制剂设计提供适应性强的抑制剂
研究人员基于膦酸部分的四面体几何结构与肽键水解的sp3中间体相似这一特点进行设计。抑制剂的核心结构模拟 β- 内酰胺抗生素的水解产物，且不会被金属 β- 内酰胺酶进一步水解。其与酶活性位点的 Zn 离子紧密结合，抑制酶对 β- 内酰胺抗生素的水解。同时，引入苯环和酚羟基，增强与催化位点的相互作用，并通过调整亲疏水侧链，平衡其水溶性和脂溶性。此外，在 Zn 结合基序旁引入动态手性中心，使抑制剂能在生理条件下快速互变，适应不同的结合环境，有望抑制多种金属 β- 内酰胺酶并防止耐药性产生。
简便合成提供多样的膦酸类化合物
研究人员建立了一种简便的四步合成路线，通过 Kabachnik-Fields 反应构建核心结构，再经氢化脱保护、酰胺偶联和同时脱保护等步骤，以 70% 的平均产率得到目标产物。该方法可利用多种市售羧酸实现结构多样化，最终产物为立体动态的不可分离对映体混合物。
广谱金属 β- 内酰胺酶抑制活性且无细胞毒性
对合成的化合物 5a - m 进行酶活性测定，结果显示它们对 VIM-2、GIM-1 和 NDM-1 均有抑制活性，部分化合物能抑制多种酶，且IC50处于低微摩尔范围。其中，5d、5f 和 5g 等含有非柔性和大体积取代基的化合物抑制活性较强。Lineweaver-Burk 分析证实其为竞争性抑制。此外，这些化合物对人 HepG2 细胞均无明显细胞毒性。这表明引入膦酸部分可增强抑制剂活性，膦酸类化合物是极具潜力的药物开发起点。
外膜囊泡内的酶抑制揭示膜通透性
利用携带金属 β- 内酰胺酶的外膜囊泡评估抑制剂的跨膜能力。实验结果显示，在抑制剂 5a - m 存在的情况下，外膜囊泡内 VIM-2、NDM-1 或 GIM-1 的活性降低，表明这些化合物能够有效穿过革兰氏阴性菌的外膜。用 Triton X-100 透化膜后，化合物对游离酶的抑制活性相当，说明图 2b 中的活性变化并非由化合物的通透性差异导致。
膦酸酯型金属 β- 内酰胺酶抑制剂影响细菌
通过纸片扩散实验评估抑制剂对活细菌的酶抑制活性。在含有抗生素的纸片中添加抑制剂后，与未添加抑制剂的野生型大肠杆菌 TOP10 相比，抑制圈直径增加了 10% - 30%，表明化合物在细菌中对 VIM-2 有一定抑制作用，这与酶抑制和膜通透性实验结果相符。此外，计算预测 5a - m 具有高生物利用度。
溶液 NMR 进一步证实酶 - 抑制剂结合
利用溶液 NMR 光谱技术对15N标记的 VIM-2 进行滴定实验，结果显示 5c、5d、5g、5i 和 5j 在滴定过程中引起的1H和15N化学位移变化相似，表明它们在相同结合位点以相似模式结合。结合位点涉及 β - 折叠 3、疏水环 3 以及环 - 5、 - 10 和 - 12 等区域的氨基酸残基。NMR 数据还表明该抑制作用是可逆的。
X 射线衍射证实立体动态结合
将 5c、5d、5g 和 5j 与 VIM-2 共结晶并进行 X 射线衍射分析，结果证实抑制剂以相似模式结合到相同结合位点。膦酸部分与 Zn 离子的相互作用最强，根据抑制剂的立体化学，还可能与 Asp118 或 Asn210 形成氢键。此外，抑制剂的疏水部分与酶之间存在 π - π 堆积或阳离子 - π 相互作用。晶体结构显示，同一抑制剂的 (R)- 和 (S)- 对映体以约 180° 旋转的不同结合姿势与 VIM-2 结合，这体现了抑制剂结合模式的高度多样性。
与先前抑制剂及水解抗生素结合模式的比较
通过对比已有的抑制剂和水解抗生素与 VIM-2 的结合模式，发现本研究中的膦酸类抑制剂与它们存在差异。例如，[(5,7 - 二溴 - 2 - 氧代 - 1,2 - 二氢喹啉 - 4 - 基) 甲基] 膦酸的结合模式与本研究抑制剂不同，其 π - 堆积相互作用不明显；6 - (膦酰甲基) 吡啶 - 2 - 羧酸与 IMP-1 的结合模式也与本研究抑制剂有根本区别。与硼酸盐类抑制剂相比，本研究的动态手性膦酸抑制剂更为灵活，能在活性位点采取多种取向。
计算模拟证实保守的结合模式
通过将计算对接技术与实验数据进行基准比对，验证了该技术的预测能力。计算结果显示，抑制剂 5a - m 与 VIM-2、NDM-1 和 GIM-1 的结合模式相似，膦酸部分与酶活性位点 Zn 离子的配位是关键相互作用。同时，分子动力学模拟表明抑制剂与酶的结合模式在模拟过程中保持稳定，且预测的结合模式与 NMR 滴定实验中观察到的化学位移变化相符。
立体动态抑制剂有望对抗点突变导致的耐药性
通过对 VIM-2、NDM-1 和 GIM-1 的结合口袋进行计算饱和诱变筛选，再对抑制剂 5c 和 5d 的对映体进行分子对接，发现大部分突变不会显著削弱抑制剂的结合能力。这表明立体动态抑制剂的对映体在溶液中快速互变，能够适应酶的突变，降低耐药性产生的风险。不过，这种适应性也可能增加其与人类金属酶结合的风险，引发不良副作用。
研究人员成功开发出动态手性膦酸类金属 β- 内酰胺酶抑制剂，这类抑制剂具有独特的结构和功能优势，在对抗抗生素耐药菌方面展现出巨大潜力。它们不仅能够抑制多种金属 β- 内酰胺酶，还具有良好的膜通透性和低细胞毒性。同时，其立体动态的结合模式使其对酶的突变具有较强的适应性，有望克服细菌的耐药性。然而，研究也指出需要关注其潜在的脱靶效应。这项研究为开发新型抗菌药物提供了新的思路和方向，未来有望进一步优化抑制剂结构，提高其疗效和安全性，为解决全球抗生素耐药问题做出更大贡献。
