SPECTRE-Plex：开启组织空间分析的高效新征程

为解决现有多重抗体荧光标记技术在成本、时间和技术复杂性方面的局限，研究人员开展 SPECTRE-Plex（Spatial Photo-inactivation Enhanced Cyclic Target REsolved multiPlexing）技术研究。结果显示该技术高效、低成本，应用于十二指肠组织分析揭示疾病相关细胞变化，对组织研究意义重大。

　　在生命科学的探索旅程中，深入了解组织的奥秘对于解析健康与疾病状态下的器官生物学意义非凡。想象一下，组织就像一座精密运转的城市，细胞是城市里各司其职的居民，蛋白质则是传递信息、维持城市运作的 “使者”。要想真正明白这座 “城市” 如何在健康时和谐运转，又为何在疾病时陷入混乱，就必须精准掌握细胞和蛋白质的 “居住分布” 与 “交流互动” 情况。

随着科技发展，多重抗体荧光标记技术为研究人员打开了观察组织微环境的新窗口，让他们能更细致地窥探细胞和蛋白质的世界。然而，目前的多种方法就像带着镣铐跳舞，存在诸多限制。比如成本高昂，使得许多研究望而却步；操作流程繁琐，耗费大量时间和精力；技术复杂，对研究人员和实验设备要求苛刻，这些都严重阻碍了相关研究的推进。

为了突破这些困境，来自哈佛医学院波士顿儿童医院（Boston Children’s Hospital, Harvard Medical School）的研究人员迈克尔?D?安德森（Michael D. Anderson）、阿比盖尔?普洛内（Abigail Plone）等，踏上了创新技术的研发之路，他们的研究成果 SPECTRE-Plex（Spatial Photo-inactivation Enhanced Cyclic Target REsolved multiPlexing，空间光灭活增强循环靶标分辨多重检测技术 ）为组织空间分析带来了新的曙光，该研究成果发表在《Communications Biology》上。

研究人员在这项研究中运用了一系列关键技术方法。首先，搭建了基于优化直立水浸物镜的成像和流体系统，结合定制方案实现可重复的迭代图像采集；其次，开发了新型微流控成像腔系统，内置折射率匹配光学窗口，能在多种分辨率下成像；此外，还创新了快速、不产生气体的染料灭活方法，大幅缩短实验周期。研究采用的样本来自波士顿儿童医院伦理委员会批准下获取的十二指肠、脾脏和结肠组织切片，涵盖了乳糜泻患者和年龄匹配的健康对照人群。

研究结果

1. 系统设计优化与实验时间缩短：SPECTRE-Plex 系统设计巧妙，样本在载玻片上就能完成染色、洗涤、成像和染料灭活等一系列操作，各步骤紧密衔接，实验周期显著缩短。以往，大多数手动或半自动化的循环方法完成 7 个周期的实验需要 14 - 36 小时，而 SPECTRE-Plex 系统仅需 8 小时，就像为实验装上了 “加速引擎”。这一提升得益于系统集成的定制光学元件、小体积流体系统，以及基于 Python 和 μ - manager 软件的成像与设备控制，实现了各环节的高效协同。
2. 新型染料灭活剂优势凸显：在染料灭活环节，研究人员深入探究了花青和罗丹明类荧光团的灭活化学机制，惊喜地发现间氯过氧苯甲酸（mCPBA）比以往常用的染料灭活剂表现更为出色。mCPBA 对多种常用共轭荧光团的灭活速度比硼氢化锂（LiBH₄）和过氧化氢（H₂O₂）快得多，而且它在溶液中不会产生氧气，避免了因气泡干扰成像和影响微流控应用的问题。同时，实验验证 mCPBA 在高达 40 个周期的实验中，不会对组织质量造成明显损害，这为其在长时间、多轮次实验中的应用提供了有力保障。
3. 成像分辨率提升：针对现有自动化循环荧光团染色方法因空气物镜和玻璃腔室窗口导致的成像分辨率和放大倍数受限问题，研究人员研发了基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）的微流控装置 “invisi - slip”，嵌入氟化乙烯丙烯（FEP）窗口。FEP 聚合物与水的折射率相同，能与水浸物镜完美配合，消除成像像差。研究人员分别使用 16×0.8 NA 和 60×1.2NA 的水浸物镜进行成像实验，结果显示，后者能够实现亚细胞分辨率的靶蛋白成像，让研究人员能更清晰地观察细胞内的蛋白质分布细节。
4. 抗体结合动力学评估：SPECTRE-Plex 系统独特的原位成像和共轭抗体标记设计，为直接在组织上研究抗体与靶标的结合动力学提供了可能。以抗 Muc2 IgG 抗体为例，研究人员通过调节溶液的温度和 pH 值进行实验。在 22℃时，抗 Muc2 抗体呈现单相结合，平均半衰期为 50 分钟，溶液 pH 值对其结合动力学影响不大，但将温度升高到 37℃时，半衰期显著缩短至 13 分钟。不过研究也发现，并非所有抗体都呈现这样的温度依赖性结合动力学变化，这一现象为进一步深入研究抗体结合行为提供了新的方向。这种对抗体结合动力学的直接评估能力，在抗体的组织特异性验证、治疗性抗体或小分子药物结合效果快速评估等方面具有重要应用价值。
5. 组织空间分析揭示疾病相关细胞变化：研究人员利用 SPECTRE-Plex 系统对患有活动性乳糜泻的儿童和年龄匹配的健康对照儿童的十二指肠组织进行了 22 重成像分析。通过定制的图像分析流程，包括自适应分割和细胞坐标映射，深入探究了组织的细胞组成和空间分布特征。细胞组成分析发现，乳糜泻组织与健康组织存在明显差异，肠道内分泌细胞增多，免疫细胞扩张，细胞空间异质性增加；增殖性（PCNA⁺）上皮细胞相对扩张，且出现局部高密度区域，非上皮细胞区的细胞密度也有所上升。对簇绒细胞（tuft cell，一种参与管腔营养和病原体感知的上皮细胞谱系）的分析显示，其在健康组织和乳糜泻组织中的分布和聚集模式存在差异。此外，对 pEGFR⁺簇绒细胞的邻域细胞 - 细胞分析表明，与健康对照组相比，乳糜泻患者中 pEGFR⁺簇绒细胞与增殖和分化的上皮细胞的空间关联增加。研究人员还对结肠组织和脾脏组织进行了多重免疫荧光实验，进一步验证了该技术的通用性。

研究结论与讨论

SPECTRE-Plex 技术整合了优化的成像、微流控和染料灭活方法，成功克服了现有多重免疫荧光成像技术的诸多局限，为组织空间分析提供了一种快速、高分辨率且成本相对较低的解决方案。通过对健康和患病组织的深入研究，揭示了细胞组成、分布和相互作用的变化规律，为理解疾病机制提供了重要依据。例如在乳糜泻研究中，发现的细胞层面的变化有助于深入探究疾病的发生发展过程，为开发新的诊断方法和治疗策略奠定了基础。

展望未来，研究人员计划对该技术进行进一步优化，增加多载玻片配置以实现高通量实验和筛选，引入共聚焦光学元件实现三维样本成像，从而拓展其应用范围。同时，SPECTRE-Plex 技术的成像和微流控模块还具有广泛的应用潜力，可迁移到 RNA 分析、条形码技术以及定量组织结合研究等其他组织成像领域，有望为生命科学和健康医学研究带来更多突破，推动相关领域的快速发展。