猪流行性腹泻病毒包膜蛋白中 13 位天冬酰胺对病毒致病性的影响：揭示关键靶点与潜在疫苗开发新方向

猪流行性腹泻病毒（PEDV）致病机制尚未完全明晰，严重阻碍疾病防控。研究人员围绕 PEDV 包膜（E）蛋白 13 位天冬酰胺展开研究，发现其影响炎症反应和病毒毒力。该研究为探索 PEDV 致病机制提供新视角，也为开发减毒活疫苗提供新靶点。

　　在养猪业的 “战场” 上，猪流行性腹泻病毒（PEDV）是一个令养殖户们头疼不已的 “敌人”。自上世纪 70 年代起，PEDV 就在许多国家 “安营扎寨”，时不时兴风作浪。2010 年，高致病性变异株在我国出现，给全球猪肉产业带来了巨大的经济损失。直至今日，它依旧是影响全球养猪业健康发展的重大挑战。

目前，疫苗免疫和药物治疗是对抗 PEDV 的 “常规武器”，可由于 PEDV 的致病机制大多还是未知数，这就像在迷雾中作战，让开发有效疫苗和药物变得困难重重。比如，病毒感染通常会引发炎症反应，PEDV 的 E 蛋白也能诱导促炎细胞因子的产生，但这些炎症反应在 PEDV 致病过程中到底扮演着什么角色，科学家们还不清楚。为了揭开这些谜团，中国农业科学院兰州兽医研究所的研究人员踏上了探索之旅，他们的研究成果发表在了《Veterinary Research》上。

研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：一是构建重组病毒技术，以高致病性 rPEDV GII 组毒株为基础，构建携带 E 基因 N13A 突变的重组毒株 rPEDV-E_N13A；二是多种检测技术，像间接免疫荧光试验（IFA）、蛋白质免疫印迹法（Western blot）、实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）等，用来检测病毒相关蛋白表达、细胞因子 mRNA 水平等；三是动物实验，选用 21 只新生仔猪分为三组进行感染实验，评估重组毒株的致病性。

下面来看具体的研究结果：

1. E 蛋白关键氨基酸位点分析：通过对冠状病毒 E 蛋白进行多序列比对，发现 13 位的极性不带电残基是保守的。这一发现就像找到了一把可能打开 PEDV 致病机制大门的钥匙，暗示这个位点或许在 PEDV 的致病过程中有着重要作用。
2. E_N13A过表达对炎症反应激活的影响：构建 E 和 E_N13A真核表达质粒后发现，E 能显著增强 NF-κB 启动子活性，上调 IL-6、IL-8 和 TNF-α 等促炎细胞因子的 mRNA 水平；而 E_N13A则降低了这种激活作用，相关细胞因子的 mRNA 水平也明显下调。这表明 E 蛋白的 13 位氨基酸对于激活 NF-κB 通路和上调炎症细胞因子表达至关重要。
3. 重组毒株的构建与鉴定：成功构建并拯救出携带 N13A 突变的重组毒株 rPEDV-E_N13A。Western blot 和 IFA 检测证实了病毒的成功拯救，桑格测序也表明拯救出的就是 N13A 突变株，为后续研究奠定了基础。
4. 重组毒株的体外特性：体外实验中，rPEDV-E_N13A形成的噬菌斑比野生型 PEDV 小，在感染 MARC-145 细胞后的 24、36 和 48 小时，其病毒滴度也低于亲本病毒。这说明 rPEDV-E_N13A在体外的生长存在缺陷。
5. 重组毒株对炎症反应的影响：用 rPEDV 和 rPEDV-E_N13A感染 MARC-145 细胞和 Vero 细胞后发现，rPEDV-E_N13A感染组的 TNF-α、IL-8 和 IL-6 转录水平显著下调，表明 N13 在 PEDV E 蛋白的炎症激活中起着关键作用。
6. 重组毒株在仔猪中的致病性评估：在仔猪实验中，虽然所有组最终腹泻率都达到 100%，但 rPEDV-E_N13A组腹泻高峰出现更晚，且在感染初期腹泻症状更轻。该组仔猪死亡时间延迟，粪便中 PEDV RNA shedding 水平更低，小肠绒毛的组织病理学损伤也更轻微，说明 rPEDV-E_N13A重组毒株在新生仔猪中致病性减弱。同时，rPEDV-E_N13A感染仔猪的小肠中，病毒载量和 IL-6、IL-8、TNF-α 等细胞因子的 mRNA 表达水平也更低，进一步证实其在体内诱导的炎症反应较弱。

综合上述研究，研究人员得出结论：E 蛋白的 N13 是激活炎症的关键氨基酸位点，E_N13A蛋白或 rPEDV-E_N13A毒株诱导的炎症反应更低，且 rPEDV-E_N13A毒株在仔猪中致病性减弱。这一研究成果意义重大，它丰富了我们对 PEDV 致病机制的认识，就像为我们绘制了一张更清晰的 PEDV 致病 “地图”。同时，也为开发针对 PEDV 的疫苗和药物提供了新的靶点，让我们在对抗 PEDV 的道路上有了更明确的方向，有望为养猪业抵御 PEDV 的侵害提供更有效的 “武器”。