力谱技术揭示细胞外纳米囊泡的膜波动和表面黏附对其弹性行为的影响：为细胞间通讯研究提供关键线索

本文通过力谱技术研究细胞外囊泡（EVs）的纳米力学特性。开发了一套包含理论框架、实验技术和统计方法的方案，量化了 EVs 的弯曲和弹性模量。发现膜波动和组成异质性影响其弹性，且蛋白质改变对弹性模量有潜在影响，为 EVs 研究提供了重要参考。

　　

1. 研究背景

细胞外囊泡（EVs）在病理生理过程中具有多种作用，其携带细胞成分并传递生物活性物质，影响细胞功能。对 EVs 的研究虽取得进展，但因其高度异质性，仍存在诸多疑问，如是否存在功能不同的 EV 亚群，以及何种属性可作为功能差异的最佳指标。现有技术难以在单个囊泡水平进行全面化学分析，原子力显微镜（AFM）为研究 EVs 的刚度、弯曲模量和黏附等特性带来希望。然而，准确量化 EVs 的刚度模量存在困难，此前基于 AFM 的研究方案存在缺陷，未充分考虑表面黏附力和膜波动的影响，且未明确膜蛋白组成改变对 EV 弹性的影响。

2. 研究方法

1. 样本制备：从人胚胎肾（HEK293T）细胞系及其基因工程改造版本中提取、纯化和分离 EVs，通过基因编辑改变四跨膜蛋白的表达，获得不同类型的 EVs 样本，包括野生型（WT-EVs）、CD63 敲除（CD63-KO）和 CD9-CD63-CD81 敲除（Pan-KO）样本，还对 WT-EVs 进行额外处理得到 WT-SEC 样本。同时制备两种不同组成的脂质体用于对比研究。
2. 实验技术：使用 AFM 在液体环境（1×PBS）中对 EVs 进行力谱测量。在测量前，将 EVs 固定在经处理的盖玻片上，确保其在测量过程中保持静止。通过成像观察 EVs 的形状，测量力 - 距离曲线，并多次重复测量以获取可靠数据。
3. 理论模型：基于 Canham-Helfrich 模型解释力 - 距离曲线。该模型考虑了 EVs 作为流体膜包裹的囊泡，在受力变形时能量变化源于面积、体积和曲率或弯曲的改变。在本研究中，假设 EVs 体积在测量过程中不变，仅面积发生变化，并通过理论分析和实验验证了该假设的合理性。
4. 数据分析：运用统计方法分析实验数据，计算有效弹性模量和弯曲模量的概率分布函数（PDFs）。由于 PDFs 并非简单的高斯分布，使用 Jensen-Shannon 散度来区分不同样本的 PDFs，以评估样本间的差异。

3. 研究结果

1. 黏附囊泡的形状：AFM 测量显示，EVs 在液体环境中的形状近似为球形帽。通过拟合圆并考虑 AFM 针尖形状校正，确定了 EVs 的有效半径（Rc），其范围约为 40 - 100nm，大多属于小 EVs（sEVs）。实验过程中对每个 EV 进行成像和力谱测量，并确保测量前后 EVs 未受损或移动。
2. 力 - 距离测量
   • 理论分析：EVs 不能用 Hertzian 接触力学或标准薄壳理论进行建模，而应采用 Canham-Helfrich 模型。在小变形情况下，力（F）与变形（d）呈线性关系F∝d，但无法直接确定弹性模量KA，因此定义了有效弹性模量KA。通过详细的数值模拟和实验数据拟合，可以得到模型的拟合参数KA和预张力σ0，实验数据与模型拟合结果吻合良好，验证了模型的适用性。
   • 实验结果：对单个 EV 进行多次力 - 距离测量，发现每次测量得到的曲线存在较大差异。通过拟合力 - 距离曲线的初始部分（前 10% 的压痕）得到每个 EV 的有效模量KA，不同样本家族的KA均值和标准差有所不同。例如，WT 家族的KA均值为 8.5 mN/m，标准差为 3.9 mN/m；CD63-KO 家族的均值为 12.0 mN/m，标准差为 3.8 mN/m。PDFs 显示，这些数据不能用单一高斯分布近似，而是多个高斯分布的叠加。
3. 有效弹性模量的变化：不同样本家族的有效弹性模量存在固有异质性。由于 PDFs 非高斯分布且样本量较小，使用 Jensen-Shannon 散度衡量不同 PDFs 之间的差异。结果表明，大多数情况下，家族内的弹性模量变化较大，难以检测到蛋白质改变引起的家族间的显著差异。仅 CD63-KO 家族与其他家族在有效弹性模量上存在一些统计差异，如 CD63-KO 家族的KA与 Pan-KO 家族有显著差异。
4. 弯曲模量的测量：在 AFM 测量的回缩曲线中，部分 EVs 出现系链形成的现象。与传统管拉实验中系链形成的力 - 距离曲线不同，本实验中力（F）随系链长度（L）增加而变化，且F/L近似为常数。根据相关理论公式计算得到不同样本家族的弯曲模量，其 PDFs 同样不是单一高斯分布。通过 Jensen-Shannon 散度分析，发现 CD63-KO 家族的弯曲模量与 WT 家族存在（略微）统计差异。

4. 脂质体实验

对两种不同组成的脂质体进行实验，一种脂质体的磷脂和胆固醇含量模拟 EVs，另一种为凝胶相脂质且胆固醇含量较低。结果显示，模拟 EVs 的脂质体在力 - 距离曲线中KA的变化与 EVs 相似，且在小力（0.5 nN）作用下系链形成的行为也与 EVs 一致；而胆固醇含量较低的脂质体，其KA变化显著较小，约为前者的一半。

5. 讨论

1. 理论模型：本研究采用的理论模型与以往研究不同，假设 EVs 在压痕过程中体积不变，面积变化。这一假设基于 EVs 与 GUVs 的相似性、实验时间尺度内水渗透导致体积变化可忽略以及模型与实验数据的良好拟合。该模型为理解 EVs 的生物力学特性提供了重要指导。
2. AFM 测量的波动：EVs 的 AFM 力 - 距离曲线存在随机波动，可能由热波动和膜分子扩散引起。热波动方面，通过定义类似的弹性热数（ET），发现其大于 1，表明热效应在 EVs 中较为重要；膜分子扩散方面，蛋白质和脂质域的扩散可能导致每次测量得到的弹性模量不同。脂质体实验也表明，波动部分取决于囊泡的化学成分。
3. 系链形成：传统理论用于解释 GUVs 和细胞系链形成的力 - 距离曲线，但在本实验中并不适用。本研究中 EVs 系链形成呈现线性力 - 距离关系，这是首次基于相关理论对该现象进行的实验观察，为研究 EVs 的力学特性提供了新的视角。
4. EVs 的异质性：EVs 的弹性模量 PDFs 并非高斯分布，而是多个高斯分布的叠加，反映了 EVs 的自然异质性。这要求采用更适合的统计方法，如 Jensen-Shannon 散度，来分析 EVs 的特性。
5. 区分 EV 亚群：通过敲除四跨膜蛋白研究 EVs 的弹性特性与膜蛋白组成的关系，发现大多数情况下，家族内弹性模量的自然变化过大，难以检测到蛋白质改变引起的家族间的显著差异。仅 CD63-KO 家族在有效弹性模量和弯曲模量上与部分家族存在统计差异，这表明在区分 EV 亚群时，不能仅依赖均值，而应考虑完整的 PDFs。同时，早期实验可能低估了误差。

6. 研究结论

本研究开发了一套准确量化 EVs 弯曲和弹性模量的方案，揭示了膜波动和表面黏附对 EVs 弹性行为的重要影响。发现 EVs 弹性模量存在较大的固有异质性，热波动和膜分子扩散是导致测量波动的重要因素。此外，通过对不同基因工程改造的 EVs 样本研究，初步探讨了膜蛋白改变对弹性模量的影响，但由于样本间的自然差异，多数情况下难以检测到显著变化。本研究为细胞外囊泡的纳米力学特性研究提供了重要参考，有助于推动该领域的进一步发展。