Cardinium 干扰家螨共生菌关系：揭示细胞内共生菌互作新机制

本文研究了家螨（Tyrophagus putrescentiae）中两种细胞内共生菌 Cardinium 和 Wolbachia 的三方相互作用。通过基因组测序和基因表达分析发现，混合感染时 Cardinium 干扰 Wolbachia 与宿主的互作，影响宿主免疫和代谢等通路，这为理解共生菌相互作用及相关疾病防控提供新视角。

　　### 研究背景
内共生细菌 Cardinium（属于 Cytophagales 目）和 Wolbachia（属于 Alphaproteobacteria 门）是生殖寄生虫，可通过诱导细胞质不相容性（CI）、雌性化、雄性致死和孤雌生殖等方式影响宿主繁殖。它们在陆地节肢动物中广泛存在，分别感染约 13% 和 52% 的物种 。部分 Wolbachia 菌株可作为有益的营养共生菌，为宿主提供生物素（维生素 B₇），增强宿主适应性；Cardinium 基因组虽缺乏多数主要生物合成途径，但可能为宿主提供硫辛酸和生物素 。此外，Wolbachia 还具有病原体阻断作用，能限制许多病原体在宿主体内生长，在控制蚊媒或蜱传疾病方面具有潜在应用价值。

节肢动物宿主可能感染单一细菌共生菌或多种细菌。在家螨中，虽然通常为单一感染，但已有报道在一些植食性螨类中存在 Cardinium 和 Wolbachia 的双重感染 。然而，对于多感染宿主中这两种共生菌的相互作用，人们了解甚少，相关研究存在空白，尤其是缺乏结合共生菌和宿主基因表达数据的研究，因此共生菌共感染有待进一步研究。

家螨（Tyrophagus putrescentiae）是一种世界性害虫，会破坏储存产品并产生过敏原。目前已知有四种感染 Cardinium（cTPut）、两种感染 Wolbachia（wTPut）和四种无菌（无 cTPut 和 wTPut）的家螨培养物，cTPut 和 wTPut 通过感染的卵进行母系传播，而潜在的肠道共生菌则通过粪便水平传播。在实验室条件下，混合单一感染的螨培养物可诱导共感染，且混合培养物中宿主适应性会降低 。本研究旨在利用螨群体水平的元转录组数据，阐明 Cardinium 和 Wolbachia 对共同螨宿主的影响差异，重点关注宿主基因表达。

研究方法

1. 单一感染螨培养物：实验使用四种感染 Cardinium 或 Wolbachia 的家螨培养物，分别为 5L（1996 年在捷克采集，感染 Cardinium）、5S（2013 年在意大利采集，感染 Cardinium）、5N（2007 年在美国采集，感染 Wolbachia）和 5P（2014 年获得，感染 Wolbachia）。这些培养物在捷克农业食品研究中心（CARC）保存，螨饲养在特定条件下，以 SPMd（小麦胚芽和干酵母提取物按 10:1 比例混合）为食。
2. 混合培养物制备：从单一感染的亲本培养物中转移 10 只未交配的成年螨（Cardinium 感染的 5L 或 5S 和 Wolbachia 感染的 5N 或 5P）到新的培养瓶中，制备混合培养物 5LN、5LP、5SN 和 5SP。每个培养瓶中有 20 只螨，培养 42 天，期间条件与螨饲养条件相同。实验设计基于家螨从卵到成虫的生命周期为 9.4 天，且实验中未观察到共生菌诱导的雌性化、雄性致死或性别比例偏差，螨的寿命也无明显变化，保证了基因表达数据的有效性。
3. RNA 和 DNA 提取：培养 42 天后，收获单一和双重感染的培养物进行转录组和基因组分析。采集活成年螨称重后，进行表面清洁，再用特定方法分别提取 RNA 和 DNA。RNA 提取使用 NucleoSpin RNA 试剂盒并进行相关修改，DNA 提取使用 QIAamp DNA Micro Kit，提取后对 RNA 和 DNA 进行质量评估和定量，然后将样本运输至实验室进行后续处理和测序。
4. 基因组和转录组测序与处理：对 RNA 样本进行处理，去除核糖体 RNA 后制备文库并测序，DNA 样本同样进行处理、制备文库和测序。测序后对数据进行处理，包括修剪、映射到参考数据集、进行从头组装和注释等，使用多种软件工具完成这些操作，并对细菌和家螨的基因表达进行分析。
5. 系统发育和分子鉴定：使用 MASH 算法和 dRep 在 Galaxy 服务器上对 Cardinium 和 Wolbachia 进行基因组水平的分类分析，在 M1CR0B1AL1Z3R 中进行开放阅读框选择、直系同源组鉴定、序列比对和构建最大似然系统发育树，最后在 iTOL v.6 中完成系统发育图。
6. 统计分析：采用非参数 Mann - Whitney 检验和 Kruskal - Wallis 检验分析单一和双重感染培养物对细菌和基因组表达的影响。使用 Shannon 多样性指数进行 α 多样性分析，通过距离 - 基于冗余分析（dbRDA）和 Spearman 相关系数进行 β 多样性分析，计算 FDR 进行 γ 多样性分析，以确定基因表达的变化。

研究结果

1. Cardinium 和 Wolbachia 的基因组特征：家螨中 Cardinium（cTput）的基因组由 55 个重叠群组成，跨度为 1.05 Mbp，与先前组装的来自家螨的 Cardinium 相似，但预测基因数量更多。cTput 与来自飞虱（Sogatella furcifera）的 Cardinium 形成姐妹群，且两者共享一些预测的 KEGG 蛋白。Wolbachia（wTput）的基因组由 26 个重叠群组成，跨度为 1.04 Mbp，与先前组装的 wTPut 相似，预测基因数量增加，且在 KEGG 蛋白预测上存在差异。wTput 属于超组 Q，与其他一些物种的 Wolbachia 聚类，其基因组包含六个完整的 KEGG 模块，但核黄素和生物素途径不完整。此外，未在 wTPut 中发现负责 CI 的蛋白证据。
2. 家螨的基因组和转录组：家螨（T. putrescentiae）的基因组和转录组进行了组装和注释，转录组包含 5,838 个 KEGG 注释蛋白，形成 66 个完整的 KEGG 模块，整个螨的宏基因组包含 80 个完整的 KEGG 模块。
3. 细胞内共生菌的基因表达：在单一和混合培养物中，cTPut 转录组读数的比例相似，但 wTPut 转录组读数比例在混合培养物中下降了 10 倍。Cardinium 的基因表达在单一和混合培养物中存在差异，而 Wolbachia 的基因表达在两种培养物中无明显差异，但通过 dbRDA 分析仍可区分。此外，cTPut 基因表达受 wTPut 存在与否的影响更大，且在混合培养物中，cTPut 对基因表达的改变比 wTPut 更大，对 wTPut 基因表达也有显著影响。
4. 基于多样性指数的基因表达分析：使用 Shannon 多样性指数分析发现，在混合培养物中，wTPut 的基因表达多样性指数略有下降，cTPut 则增加了 1.5 倍。对于螨的 KEGG 基因，wTPut 单一感染样本的表达多样性指数是 cTPut 单一感染样本和混合样本的两倍。总体而言，wTPut 与螨的相互作用水平较高，但在双重感染宿主中，cTPut 增加了与宿主相互作用的基因数量，wTPut 则减少了相互作用。
5. 基于基因表达相关性分析的 Cardinium 和 Wolbachia 相互作用：在混合培养物中，cTPut 和 wTPut 基因表达之间的负相关性数量是正相关性的 10 倍。网络分析显示，多数上调的 wTPut 基因与 cTPut 上调基因相互作用，且 cTPut 的某些转运蛋白与 wTPut 的特定蛋白有较高的正相关性。
6. 基于基因表达相关性分析的 Cardinium、Wolbachia 与螨宿主的相互作用：家螨宿主的基因表达在单一感染和混合感染样本中存在显著差异，尤其是 wTPut 感染样本与 cTPut 感染或混合样本之间。与单一感染培养物相比，混合培养物中 wTPut 与螨宿主的相互作用显著降低，cTPut 与螨宿主的相互作用则有所变化，不同基因簇表现出不同的相关性变化。
7. Cardinium 和 Wolbachia 对螨免疫、调节通路和代谢的影响：在单一感染培养物中，wTPut 与螨免疫和调节通路的相互作用比 cTPut 更多；在混合样本中，cTPut 与这些通路的相互作用增加，且混合样本中的相互作用更为复杂。此外，wTPut 单一感染样本中螨的代谢途径基因表达高于 cTPut 感染样本，混合培养物的基因表达谱与单一感染样本不同，部分代谢途径在双重感染样本中表达下降。

研究讨论

家螨中 Cardinium（cTPut）与飞虱中的 Cardinium 相关，且缺乏与其他 Cardinium 菌株相关的质粒，它具有硫辛酸生物合成途径，但无法为螨宿主提供生物素。Wolbachia（wTPut）属于超组 Q，是该属中最早分化的分支之一，主要或仅存在于螨形螨中，其基因组缺乏完整的生物素和核黄素途径，可能作为营养寄生虫发挥作用。

通过对单一感染和混合感染培养物的研究发现，Cardinium 感染的样本在单一和双重感染时基因表达不同，而 Wolbachia 则无此现象。混合培养物中 wTPut 转录组读数比例下降，可能是由于 Wolbachia 感染个体减少或其在个体中的滴度降低。此外，Cardinium 可能通过细胞质不相容性或其他优势消除 Wolbachia 感染的宿主，也可能具有病原体阻断作用，这需要在其他涉及螨和蜱传播病原体的系统中进一步研究。

cTPut 和 wTPut 的基因表达存在相关性，可能存在资源竞争，如在获取脂多糖（LPS）前体方面，cTPut 具有竞争优势。在与螨的相互作用中，wTPut 可能与螨的免疫和调节通路建立更强的相互作用，但在混合培养物中，wTPut 对这些通路的控制能力下降，cTPut 则增加了与宿主的相互作用，这种竞争可能通过间接操纵宿主途径而非直接竞争实现。

单一感染培养物中，wTPut 感染的螨在某些代谢途径上的基因表达高于 cTPut 感染的螨，而混合感染时这些代谢途径表达下降，这可能导致宿主适应性降低。本研究存在一些局限性，如使用群体水平样本无法单独分析双重感染个体、可能受其他共生菌影响以及相关性分析不能准确反映因果关系等。尽管如此，本研究建立了研究 Wolbachia 和 Cardinium 相互作用的新模型，对于理解家螨生理学、过敏原产生以及病原体传播具有重要意义，为未来相关研究提供了新的方向。