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在视觉系统中，ON 和 OFF 通路对视觉信息处理至关重要，但 OFF 通路形成机制不明。华盛顿大学医学院研究人员开展了关于分子机制建立视觉 OFF 通路的研究，发现 LRFN2 对 OFF 通路形成和功能起关键作用，这有助于理解视觉系统发育和相关疾病治疗。
在奇妙的视觉世界里，我们能轻松辨别光影变化、识别物体，这背后离不开复杂的视觉系统。视觉系统中，从苍蝇到人类，都存在着平行的 ON 和 OFF 通路（分别处理光增量和光减量信息），它们对于高效编码自然对比度分布、增强感知对比度敏感性以及构建复杂特征偏好至关重要 ，比如在视觉皮层中形成方向和方向选择性。此外，专门的 OFF 通路还能检测接近的捕食者，引发逃生反应。
然而，在哺乳动物视觉系统中，虽然 ON 和 OFF 通路在锥体光感受器的复杂突触处产生，但目前关于塑造 OFF 通路的分子机制仍存在诸多未知。例如，与 OFF 双极细胞建立基底接触并在其树突上适当位置聚集红藻氨酸和 AMPA 受体的机制尚不明确，而且也不清楚是否有相同的信号控制锥体足突与所有 OFF 双极细胞类型的连接 。为了解开这些谜团，华盛顿大学医学院（Washington University School of Medicine）的研究人员开展了深入研究。
研究人员通过多种实验方法，发现了亮氨酸丰富重复序列细胞粘附分子 LRFN2（Leucine - rich repeat - containing cell adhesion molecule 2）在视觉 OFF 通路中起着关键作用，相关成果发表在《Nature Communications》上。
在研究方法上，研究人员主要运用了以下关键技术：
- 单细胞 RNA 测序分析：对多种物种视网膜的单细胞 RNA 测序（scRNA - seq）数据进行重新分析，确定了在锥体中富集的基因，从而发现 LRFN2。
- 基因编辑小鼠模型：获取 Lrfn2 基因敲除（KO）小鼠，与其他转基因小鼠品系杂交，用于研究 LRFN2 缺失对视网膜结构和功能的影响。
- 免疫组织化学和超分辨率成像：对视网膜切片和扁平标本进行免疫组织化学染色，利用超分辨率成像技术分析 LRFN2 在锥体突触中的定位以及与其他蛋白的共定位情况。
- 电生理记录：通过膜片钳技术对双极细胞和瞬态 OFFα 神经节细胞（tOFFα cells）进行电生理记录，检测光刺激下的兴奋性和抑制性电流变化；同时进行视网膜电图（ERG）记录，测量锥体驱动的 ON 双极细胞反应。
- 成像技术：运用双光子成像技术，结合基因编码的谷氨酸传感器 iGluSnFR，分析双极细胞在不同刺激下的谷氨酸释放情况 。
下面详细介绍研究结果：
- Lrfn2 在不同物种和发育阶段的表达：通过分析 scRNA - seq 数据，研究人员发现 Lrfn2 在哺乳动物锥体中表达，而在杆体中不表达，在非哺乳动物物种中，锥体中 Lrfn2 缺失或表达选择性降低。对小鼠视网膜染色结果显示，LRFN2 在出生后 10 - 15 天可在锥体足突中检测到，这与突触发育时间一致。
- LRFN2 定位于锥体突触的 OFF 区室：通过免疫组织化学和超分辨率成像分析，研究人员发现 LRFN2 与大多数 OFF 双极细胞的突触后受体 GluK1 共分层且共定位广泛，而与其他突触伙伴的标记物重叠较少，表明 LRFN2 选择性地定位于与 OFF 双极细胞的基底接触处。
- LRFN2 控制锥体足突大小和区室特异性突触组装：研究 Lrfn2 KO 小鼠发现，虽然视网膜中细胞体位置和神经突分层模式保留，锥体数量正常，但锥体足突和活动区大小减小。进一步研究发现，LRFN2 缺失不影响与水平细胞、ON 双极细胞相关的突触标记物定位，但会导致 OFF 双极细胞突触后 GluK1 和 GluA1 无法聚集，说明 LRFN2 选择性控制锥体突触 OFF 区室的分子组装和分层。
- LRFN2 维持锥体足突与 OFF 双极细胞树突的基底接触：将 Vsx1 - cerulean 小鼠（其中 OFF 双极细胞 1 - 4 型被稀疏标记）与 Lrfn2 KO 小鼠杂交后发现，在 Lrfn2 KO 小鼠中，OFF 双极细胞树突与锥体足突分离，表明 LRFN2 除控制突触后受体聚集外，还维持着两者的基底接触。
- LRFN2 是锥体信号传递到 OFF 双极细胞所必需的：对视网膜扁平标本中的双极细胞进行全细胞膜片钳记录发现，Lrfn2 KO 小鼠中 OFF 双极细胞的兴奋性输入大幅减少，而抑制性输入不变；ON 双极细胞的突触输入在 Lrfn2 KO 和野生型小鼠之间无显著差异。ERG 结果也证实了这一点，表明 LRFN2 是将锥体信号传递到 OFF 双极细胞所必需的，且不影响同一突触处的 ON 通路。
- LRFN2 在 OFF 通路中的统一作用：利用双光子谷氨酸成像分析发现，尽管 Lrfn2 KO 小鼠中 OFF 双极细胞树突兴奋性丧失，但轴突抑制足以调节谷氨酸释放。此外，在 Lrfn2 KO 小鼠中，光诱发的 OFF 双极细胞谷氨酸释放被 mGluR6 受体激动剂 L - APB 阻断，而野生型小鼠中则持续存在，说明树突兴奋和轴突抑制都能驱动 OFF 双极细胞的谷氨酸释放，且所有 OFF 双极细胞类型的树突兴奋都依赖 LRFN2。
- LRFN2 对视觉威胁检测和先天防御行为的贡献：对 tOFFα 神经节细胞进行膜片钳记录发现，Lrfn2 KO 小鼠中其对逼近刺激的反应减弱。行为学实验表明，Lrfn2 KO 小鼠在注射 L - APB 后，对逼近刺激的冻结反应显著降低，说明 LRFN2 对 OFF 双极细胞树突兴奋以及视觉威胁检测和先天防御行为很重要。
在讨论部分，研究人员指出，LRFN2 在视觉系统中具有重要意义。它与 ON 通路中的 ELFN1 和 ELFN2 功能相似，都是通过维持与不同双极细胞类型的物理接触并组织特定突触后受体簇，来决定 ON 和 OFF 通路的功能差异 。不过，LRFN2 介导与 OFF 双极细胞的突触粘附和突触后受体聚集的具体机制，以及其跨突触控制 OFF 双极细胞的分子机制仍有待探索。此外，研究还发现，在 Lrfn2 KO 小鼠中，OFF 双极细胞虽然缺乏树突兴奋，但仍能通过轴突抑制编码亮度对比，这与它们在暗光下的功能相似。同时，ON 和 OFF 通路在视网膜输出中存在不对称性，这种不对称性优化了自然对比度分布的编码，而 LRFN2 在其中起到了关键作用，它影响 tOFFα 神经节细胞的反应和依赖这些反应的先天防御行为。
综上所述，该研究揭示了 LRFN2 在视觉 OFF 通路形成和功能中的关键作用，为深入理解视觉系统的发育和功能提供了重要依据，也为治疗与视觉通路相关的疾病提供了潜在的靶点和理论基础 。
