优化RNA pol III启动子驱动sgRNA表达提升按蚊基因驱动效率——亚洲疟疾媒介斯氏按蚊基因编辑技术突破

编辑推荐：为应对亚洲疟疾媒介斯氏按蚊（Anopheles stephensi）入侵非洲引发的防控挑战，英国皮尔布赖特研究所团队通过评估4种RNA pol III启动子（U6-C/7SK等）驱动sgRNA表达对CRISPR/Cas9基因驱动效率的影响，发现U6-C启动子可实现99.8%的遗传偏斜率，同时揭示母源沉积Cas9导致体细胞NHEJ（非同源末端连接）是驱动效率的关键限制因素，为多重sgRNA抗性管理策略提供重要工具。

　　

疟疾防控正面临前所未有的挑战：随着杀虫剂抗性的蔓延，传统防控手段逐渐失效，而亚洲疟疾媒介斯氏按蚊（Anopheles stephensi）近年入侵非洲，更导致城市疟疾暴发。这种蚊子不仅传播效率高，还与耐药疟原虫（Plasmodium falciparum）的扩散有关。世界卫生组织（WHO）已将其列为优先防控目标。在此背景下，基于CRISPR/Cas9的基因驱动技术因其物种特异性、环境友好等优势成为研究热点，但如何优化sgRNA表达以提升驱动效率仍是关键难题。

英国皮尔布赖特研究所的Estela Gonzalez、Michelle A. E. Anderson等团队在《Scientific Reports》发表研究，系统评估了4种RNA pol III启动子（U6-A/B/C和7SK）驱动sgRNA在斯氏按蚊中的表达效率。研究以cardinal（cd）基因（调控眼色素通路）为靶点，结合zpg（zero population growth）启动子调控的Cas9，通过荧光标记和粉红眼表型（cd基因敲除特征）量化驱动效率和NHEJ事件。

关键技术包括：1）基于CHOPCHOP设计sgRNA靶向cd基因；2）利用同源定向修复（HDR）将sgRNA表达盒（含不同Pol III启动子）和荧光标记基因插入cd位点；3）通过显微注射构建转基因品系；4）设计跨代杂交实验（F₀→F₂）分析遗传偏斜率和体细胞切割效应；5）广义线性混合模型（GLMM）统计不同启动子效率差异。

Pol III启动子影响遗传偏斜率
研究发现，U6-C和7SK启动子表现最优，平均遗传偏斜率分别达99.8%和98.7%，且父系携带Cas9时效率更高（p<0.001）。母源Cas9沉积导致几乎所有F₁后代出现眼镶嵌表型（体细胞NHEJ），而父源Cas9的后代极少出现此现象（LRT: χ²=30915, P<0.001），证实母源Cas9是抗性等位基因形成的主因。

切割效率决定驱动成功率
通过cd^-/-杂交实验发现，除U6-A外，其他启动子的切割效率与遗传偏斜率高度一致（U6-C近100%），表明其表达窗口与zpg-Cas9的时空重叠可能优化了HDR过程。相比之下，U6-A效率最低，提示启动子选择需匹配Cas9表达时序。

讨论与意义
该研究首次在斯氏按蚊中鉴定出3种高效Pol III启动子（U6-C/7SK/U6-B），为多重sgRNA设计（靶向同一基因不同位点以规避抗性）奠定基础。母源Cas9沉积的发现解释了既往基因驱动在母系传递中效率下降的原因，未来需探索限制Cas9生殖系特异性表达的策略。此外，启动子“时空调谐”概念的提出为其他物种的基因驱动优化提供参考。

这项研究不仅填补了斯氏按蚊基因编辑工具集的空白，更通过精准量化启动子效率与抗性机制，推动了疟疾媒介控制的实用化进程。未来，结合多重sgRNA与高效启动子的设计，有望开发出更稳健的基因驱动系统，为全球疟疾消除计划提供新武器。