靶向调控免疫：新型 PD-L1-pHLIPva改写炎症性疾病治疗格局

为解决 PD-L1-pHLIP 在近中性 pH 条件下免疫抑制功能丧失的问题，研究人员开展了关于新型 pHLIP 变体共轭 PD-L1 的研究。结果显示，PD-L1-pHLIPva在近中性 pH 缓冲液中能有效抑制 T 效应细胞功能，这为炎症性疾病治疗提供了新策略。

　　在人体的免疫系统中，免疫平衡的维持至关重要，一旦失衡，各类炎症性疾病便可能乘虚而入。其中，程序性死亡配体 1（PD-L1）与程序性死亡受体 1（PD-1）之间的相互作用，如同免疫系统的 “调节阀”，对免疫平衡的维持起着关键作用。当 PD-L1/PD-1 信号通路受损时，炎症性疾病的发病风险就会大大增加。因此，增强这条信号通路，成为了预防过度炎症反应、诱导免疫耐受的新策略。

此前，研究人员开发出一种将 PD-L1 胞外域与 pH（Low）Insertion Peptides（pHLIP，一种能在酸性环境下响应并插入细胞膜的肽）相结合的物质，即 PD-L1-pHLIP。它在弱酸性环境下展现出强大的免疫抑制活性。然而，美中不足的是，在近中性 pH 环境中，它就像失去了 “魔力”，无法有效发挥作用。这一局限性极大地限制了其在体内治疗炎症性疾病的应用，因为炎症部位的 pH 值并不总是处于弱酸性，有时会接近中性。

为了攻克这一难题，内蒙古医科大学基础医学院分子生物学研究中心、北京药理毒理研究所等机构的研究人员展开了深入研究。他们旨在开发一种在近中性 pH 环境下也能有效抑制 T 效应细胞功能的物质，从而为炎症性疾病的治疗提供更有效的手段。最终，研究人员成功构建了一种新型物质 ——PD-L1-pHLIP_va，它是通过将携带两个突变（Asp14Gla 和 Asp25Aad）的 pHLIP 变体与 PD-L1 胞外域通过 sulfo-SMCC 连接子相连而成。研究发现，PD-L1-pHLIP_va在近中性 pH 缓冲液中，能够显著抑制 T 效应细胞的增殖、活化以及促炎细胞因子的释放，这一成果为炎症性疾病的治疗带来了新的希望。相关研究成果发表在《Scientific Reports》上。

在研究过程中，研究人员运用了多种关键技术方法。在细胞层面，通过 Ficoll 梯度离心法从 BALB/c 小鼠脾脏和健康成人外周血中分离淋巴细胞和外周血单个核细胞（PBMC），用于后续实验；采用 BrdU 细胞增殖实验检测细胞增殖情况；利用 CFSE 稀释实验分析 T 细胞亚群的增殖；运用 ELISA 技术测定细胞培养上清液中细胞因子（如 IFN-γ、IL-2、IL-17A）的水平；借助流式细胞术检测细胞表面标志物（如 CD25、CD69、PD-L1）的表达。

下面来看具体的研究结果：

1. PD-L1-pHLIP 抑制 T 效应细胞功能的 pH 依赖性：研究人员分别在近中性 pH（pH6.8）和弱酸性（pH6.1）条件下，检测 PD-L1-pHLIP_wt对 T 细胞反应的抑制作用。实验结果表明，PD-L1-pHLIP_wt在 pH6.1 缓冲液中能够有效抑制淋巴细胞增殖、减少 IFN-γ 和 IL-2 分泌，并降低 T 细胞活化标志物（CD25 和 CD69）的表达；然而，在 pH6.8 缓冲液中，它却失去了这些抑制功能。这充分说明，PD-L1-pHLIP_wt的免疫抑制功能依赖于弱酸性环境。
2. PD-L1-pHLIP 在酸性条件下的细胞表面分布：研究人员进一步探究了 PD-L1-pHLIP_wt在不同 pH 缓冲液中的细胞分布情况。结果显示，在中性水溶液中，几乎看不到 PE 标记的 PD-L1-pHLIP_wt的荧光；在 pH6.8 缓冲液中，虽然在部分免疫细胞（如 NK 细胞、树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞和 B 细胞）表面能观察到荧光，但强度较弱；在 pH6.1 缓冲液中，荧光强度则明显增强。而且，在 T 淋巴细胞表面，无论在何种酸性条件下，都检测不到 PD-L1-pHLIP_wt的插入。这表明，PD-L1-pHLIP_wt在酸性条件下能分布在部分免疫细胞表面，但在近中性 pH 条件下，其在细胞表面的含量较低，不足以传递抑制信号。
3. pHLIP 变体共轭 PD-L1 的构建与验证：研究人员构建了 pHLIP 变体共轭 PD-L1（PD-L1-pHLIP_va），并通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）和串联质谱（MS/MS）验证了其合成的成功性。同时，ELISA 实验表明，PD-L1-pHLIP_va与抗 PD-L1 单克隆抗体和 PD-1 的结合能力与 PD-L1-pHLIP_wt相当，这意味着化学共轭对 PD-1/PD-L1 相互作用的影响极小。
4. PD-L1-pHLIP_va抑制 T 效应细胞反应的能力：实验发现，PD-L1-pHLIP_va在 pH6.1 和 pH6.8 缓冲液中均能显著抑制 T 细胞增殖、减少促炎细胞因子释放，并降低 T 细胞活化标志物的表达。而且，这种抑制作用具有剂量依赖性。此外，添加抗 PD-1 单克隆抗体后，PD-L1-pHLIP_va的抑制能力几乎完全丧失，这表明其抑制功能依赖于 PD-L1/PD-1 相互作用。
5. PD-L1-pHLIP_va在免疫细胞表面的丰度：与 PD-L1-pHLIP_wt相比，PD-L1-pHLIP_va在 pH6.8 缓冲液中，在 NK 细胞、树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞和 B 细胞等免疫细胞表面的荧光强度更强。这说明 PD-L1-pHLIP_va能更有效地锚定在这些细胞表面，从而解释了它在近中性 pH 条件下能够抑制 T 效应细胞功能的原因。

综上所述，研究人员成功构建了第二代 PD-L1-pHLIP，即 PD-L1-pHLIP_va。它在近中性 pH 条件下，能够通过增强 PD-1/PD-L1 信号通路，有效抑制 T 细胞介导的炎症激活，为类风湿关节炎、1 型糖尿病等 T 细胞触发的炎症性疾病的治疗提供了极具潜力的候选药物。不过，目前 PD-L1-pHLIP_va在炎症性疾病模型中的应用仍面临挑战，如炎症部位 pH 的动态变化可能导致其从细胞膜上脱落。未来，研究人员可以通过替换为双开关 pHLIP 等方式来解决这一问题，进一步评估其在体内的疗效和安全性，推动其从实验室走向临床应用的进程，为广大炎症性疾病患者带来新的曙光。